植物圈和蔬菜发酵微生物群研究的侏儒生物系统

使用此协议，我们可以解决有关微生物如何在植物层中聚集和相互作用的关键问题。利用无菌蔬菜提取物，将植物球群落的结构与植物发酵过程中的功能联系起来，这具有额外的好处。这些技术使科学家能够测试微生物在植物球中是如何相互作用的，然后跟踪这些植物球群落如何影响发酵。

要表面消毒卷心菜种子，首先将100个种子放入1.5毫升微型离心管中。将一毫升70%乙醇加入管子，然后旋涡5分钟。然后用移液器丢弃乙醇。

加入一毫升50%漂白剂，在管子中旋转5分钟，然后丢弃漂白剂。冲洗种子四次，加入一毫升的自洗脱水，使管子旋转，然后丢弃水。最后一次冲洗后，将种子浸泡在消毒的去维化水中两到八小时，在种植前软化种子涂层。

重量10克干净的钙粘土到15由2.5厘米玻璃管。在每个管中加入大约九毫升的已准备好的 MS Broth，以覆盖钙化粘土。用 22 毫米的双向试管盖松散地盖住玻璃管。

在121摄氏度下将管材在121摄氏度下自动处理60分钟。从自动管卸下管子时，将盖推到玻璃管上以密封，然后在使用前将管冷却至室温。当管子冷却后，使用超长的钳子轻轻地将一个无菌卷心菜种子放入每个管子的中心。

将管子放在一个七路托盘中，将托盘放在灯架下，在 24 摄氏度下循环 16 小时。种子将在五天后发展出他们的第一个真叶，这是第一个血管叶后，科蒂龙已经形成。它有一个皱纹的边缘，并覆盖在三梳。

要测试无菌卷心菜的不育性，请用消毒钳轻轻握住植物的底座，然后将其拉出。在将卷心菜从管子中完全取出之前，用消毒解剖剪刀小心切开根部。然后，将卷心菜叶压缩成1.5毫升微离心管。

在每个微型离心管中加入400微升PBS，并使用无菌微虫使卷心菜均质。刀片 100 微升的卷心菜均质到阿加板上，确保使用宽孔移液器尖端。要使甘油储存的接种菌株，轻轻地条纹出个别菌落到两个或三个新的板的同一介质。

将菌落排行两到五天，然后将它们从盘子刮入15毫升锥形管中，用15毫升的15%甘油。将管子彻底搅拌以混合。将一毫升的混合甘油储存放入微型离心管中，并将其储存80摄氏度，直到与剩余的14毫升甘油库存一起准备使用。

使用前一周，将一毫升等分液解冻在冰上，并放在几个不同的稀释液中，以确定接种液的浓度。当准备给卷心菜接种时，将甘油在冰上解冻，并稀释到所需的浓度。将稀释库存的 10 毫升添加到无菌泵瓶中，并将 5 种喷雾泵入大型废物收集烧杯中。

从卷心菜管上取下盖子，将卷心菜向喷雾瓶倾斜。喷洒每个卷心菜的三个泵的接种溶液，然后收获一部分卷心菜，以评估实际输入接种浓度。要收获卷心菜，请用消毒钳将其从管子中取出。

用无菌解剖剪刀切断根部，小心地放在预称无菌的微型离心管中。记录卷心菜的重量以进行将来的计算。将400微升PBS加入每个管与卷心菜，并研磨30次与微虫，然后板卷心菜均质使用宽孔移液器提示。

取出并丢弃卷心菜的最外层叶子，并切碎所有剩余的卷心菜，放入搅拌机中。混合成细浆，称量卷心菜均质。每克卷心菜加入两毫升蒸馏水。

然后通过两层篮子咖啡过滤器过滤卷心菜浆。将浆料分配到离心管中，并在20000次G下离心20分钟，或直到大颗粒从溶液中沉淀出来。拆下上一液，注意不要打扰颗粒卷心菜碎屑。

要用标准盐浓度重新创建发酵条件，在提取物中加入2%的重量。将蔬菜提取物与0.2微米过滤器连接到真空，将其放入无菌管中，并在零下80摄氏度下冷冻。种子灭菌方法测试了几个纳帕卷心菜，他们都表现出类似的增长率。

然而，其他品种的黄铜给予有限的成功，因为植物要么在消毒后发芽率低，要么茎迅速拉长，使旋转不健康的植物。微生物分离物作为单株分离物接种，或与其他分离物结合接种。每次治疗共测试了15个无菌卷心菜，并在接种后4天或10天内立即收获。

分离表明，在纳帕卷心菜植物圈的快速生长。两个酵母和三种细菌被接种到三种不同类型的无菌蔬菜提取物或SVE由红色，绿色和纳帕卷心菜。通过将每次治疗的5微升电镀到 MRS 或 YPD 的加糖板上，记录了 14 天内接种量的增长。

在整个发酵过程中对pH值的测量表明，乳酸菌能够酸化SVE至pH4以下水平，表明发酵是安全的，食用。这些方法特别适用于卷心菜微生物群，但在其他植物系统中可能有用。保持系统无菌可能具有挑战性，我们的大纲协议非常详细，但我们发现每个步骤都很重要。