Environment
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Гототобиотическая система для изучения микробиомной ассамблеи в phyllosphere и в растительной ферментации
Chapters
Summary June 3rd, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Разработан метод выращивания капусты Напа без микробов, который позволяет исследователям оценить, как отдельные микробные виды или многовидовые микробные сообщества взаимодействуют на поверхности листьев капусты. Также представлен стерильный растительный экстракт, который может быть использован для измерения изменений в составе сообщества во время брожения овощей.
Transcript
Используя этот протокол, мы можем рассмотреть ключевые вопросы о том, как микробы собираются и взаимодействуют в филлосфере. Он имеет дополнительное преимущество, что с помощью стерильного растительного экстракта, мы можем связать структуру филло сферы общин их функции во время растительного брожения. Эти методы позволяют ученым проверить, как микробы взаимодействуют в сфере филло, а затем отслеживать, как эти сообщества сферы филло могут повлиять на брожение.
Для поверхности стерилизовать семена капусты, начните с размещения 100 семян в 1,5 миллилитров микро центрифуги трубки. Добавьте один миллилитр 70%этанола в трубку и вихрем его в течение пяти минут. Затем используйте пипетку, чтобы отказаться от этанола.
Добавить один миллилитр 50%отбеливатель и вихрь трубки в течение пяти минут, а затем отказаться от отбеливателя. Промыть семена четыре раза, добавив один миллилитр autoclaved деионизированной воды вихри трубки, а затем отбрасывая воду. После последнего полоскания замочите семена в стерилизованной деионизированной воде в течение двух-восьми часов, чтобы смягчить семенной слой перед посадкой.
Взвесите 10 граммов чистой глины кальция в стеклянную трубку 15 на 2,5 сантиметра. Добавьте приблизительно 9 миллилитров подготовленного бульона MS к каждой пробке для того чтобы покрыть кальциевые глины. Свободно крышка стеклянные трубки с 22 миллиметров в два пути пробирки шапки.
Автоклав труб при 121 градусе по Цельсию в течение 60 минут. При удалении трубок из автоклава, нажмите шапки на стеклянные трубки, чтобы запечатать их, а затем охладить трубки до комнатной температуры перед использованием. Когда трубки остыли, использовали дополнительные длинные типсы, чтобы аккуратно поместить одно стерильное семя капусты в центр каждой трубки.
Кружева трубки в семь лоток и поместите лоток под свет стеллажи с 16-часовой световой цикл при 24 градусов по Цельсию. Семена будут развиваться их первый истинный лист через пять дней, который является первым сосудистым листом после cotyledons сформировались. Он имеет морщинистую кромку и покрыт трикомбами.
Чтобы проверить капусту без микробов на бесплодие, аккуратно схвяйте основание растения стерилизованными типсами и вытащите его. Перед тем, как полностью удалить капусту из трубки, аккуратно отрежьте корни стерилизованными ножницами для вскрытия. Затем уплотняете листья капусты в 1,5 миллилитровую микро центрифугу.
Добавьте 400 микролитров PBS к каждой микро-центрифуге трубки и использовать стерильный микро пестик для гомогенизации капусты. Лезвие 100 микролитров капусты гомогената на агар пластины, убедившись, что использовать широкий кончик отверстия пипетки. Чтобы сделать запасы глицерола инокуляции штаммов, осторожно полоса из отдельных колоний на две или три новые пластины одного и того же средства массовой информации.
Строка колоний в течение двух-пяти дней, а затем соскребать их из пластин в 15 миллилитров конической трубки с 15 миллилитров 15%глицерол. Vortex трубки тщательно перемешать. Aliquot один миллилитр смешанного глицерола в микро центрифугу трубки и хранить его 80 градусов по Цельсию до готовности к использованию вместе с остальными 14 миллилитров глицерола фонда.
За неделю до использования оттаивать один миллилитр aliquot на льду и поместить его на несколько различных разбавлений для определения концентрации прививки фонда. Когда готовы привить капусту, разморозить запас глицерола на льду и разбавить его до нужной концентрации. Добавьте 10 миллилитров разбавленного бульона в стерильную бутылку насоса и накачайте пять спреев в большой стакан для сбора отходов.
Снимите крышку с капустной трубки и наклоните капусту к бутылке спрея. Спрей каждой капусты с тремя насосами прививки раствора, а затем собрать подмножество капусты для оценки фактической концентрации входной прививки. Чтобы собрать капусту, удалите ее из трубки с стерилизованными типсами.
Отрежьте корни стерильными ножницами для вскрытия и аккуратно поместите их в предварительно взвешенную стерильную трубку микро центрифуги. Запись веса капусты для будущих расчетов. Добавить 400 микролитров PBS к каждой трубке с капустой и измельчить его 30 раз с микро пестика, а затем пластины капусты гомогената с помощью широкого отверстия пипетки советы.
Удалите и отбросьте внешние листья капусты и нарежьте всю оставшуюся капусту, чтобы поместиться в блендер. Смешайте его с тонкой мякотью и взвесить гомогенат капусты. Добавьте два миллилитров дистиллированной воды на грамм капусты.
Затем фильтровать капусту суспензии через два слоя корзины фильтры кофе. Обойти суспензию в центрифугу труб и центрифугировать его в 20 000 раз G в течение 20 минут или до тех пор, пока крупные частицы оседают из раствора. Удалить супернатант, заботясь, чтобы не беспокоить гранулы капусты мусора.
Чтобы воссоздать условия брожения со стандартными концентрациями соли, добавьте к экстракту 2%-ный вес хлорида натрия. Bilder овощной экстракт с 0,2 микрометрового фильтра прилагается к вакууму, обойтись его в стерильные трубки и заморозить его при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Метод стерилизации семян был протестирован с несколькими капустой Напа, и все они продемонстрировали аналогичные темпы роста.
Тем не менее, другие виды brassica дал ограниченный успех, потому что растения либо были низкие темпы прорастания после стерилизации или стволовые удлиненные быстро, чтобы сделать spindly нездоровое растение. Микробные изоляты были привиты либо как одиночные изоляты штамма, либо в сочетании с другим изолятом. В общей сложности 15 капуст без микробов были протестированы для каждого лечения и собраны либо немедленно, в течение четырех дней или через 10 дней после прививки.
Изоляты продемонстрировали быстрый рост в напа капусты Phyllosphere. Два дрожжа и три бактерии были привиты в три различных типа стерильного растительного экстракта или SVE из красной, зеленой и капусты Напа. Рост прививки был зарегистрирован в течение 14 дней путем точечного покрытия пяти микролитров каждого лечения либо на MRS или YPD агар пластин.
Измерения рН на протяжении всего брожения показали, что молочнокислые бактерии были способны подкисления SVE до уровня ниже рН четыре, что свидетельствует о брожении, что является безопасным для потребления. Эти методы специально применяются к микробиому капусты, но могут быть полезны в других системах растений. Это может быть сложной задачей, чтобы сохранить систему стерильной, наши протоколы набросков подробно, но мы обнаружили, что каждый шаг будет иметь важное значение.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
