Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
In Vivo Inriktning av neurala progenitorceller i Iller Neocortex av In Utero Electroporation
Chapters
Summary May 6th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Presenteras här är ett protokoll för att utföra genetisk manipulation i embryonala iller hjärnan med hjälp av in utero elektroporation. Denna metod möjliggör inriktning av neurala stamceller i neocortex in vivo.
Transcript
Detta protokoll gör det möjligt för oss att utföra en genetisk manipulation in vivo i en viktig djurmodell som tillåter oss att studera expansion och vikning av en utvecklande neocortex. Den största fördelen med denna metod är att använda hög rumslig och tidsmässig specificitet i inriktning på de neurala stamceller som är den viktigaste celltypen för hjärnans utveckling. Innan du börjar förfarandet, dra glas kapillärer på en mikro pipett puller och använda forceps för att skära av den distala delen av kapillären att justera diametern på kapillärspetsen.
På embryonal dag 33, tillsätt lämplig koncentration av DNA i PBS, kompletterad med 0,1%Fast Green med skonsam blandning, och placera en 3-timmars fastad, sövd, gravid honarett på ett operationsbord med en värmedyna. Bekräfta lämplig nivå av sedering genom att vidröra den periokulära huden och nypa huden mellan andra och tredje eller tredje och fjärde tårna i båda bakbenen. Isofluran kan orsaka negativa effekter, inklusive illamående och yrsel.
Vid hantering av isofluran i flytande form, använd skyddsutrustningen. Under operationen, använd lämpliga behållare för att fånga upp gasen. Injicera djuret subkutant med smärtstillande, antibiotika och glukos, och placera salva på djurets ögon.
Använd clippers att raka buken, och rengöra den exponerade huden med ett vatten, tvål, och jod lösning. Torka sedan huden med gaskompresser och desinficera med alkohol och jodscrubs. För in utero elektroporation, placera en steril drapera över djuret och använda en skalpell för att göra en cirka 5-centimeter hud snitt vid linea alba.
Använd sax för att skära igenom muskelskiktet och placera gaskompresser runt snittstället. Blöt gasbindet med PBS och placera livmodern på svabbarna. Med hjälp av en pipett med lång spets, ladda en av de dragna glaskambillärerna med 5 mikroliter DNA-lösning per embryo som ska injiceras.
Fäst den belastade kapillären på en hållare och anslut hållarens andra sida till ett rör och ett munstycke. Lokalisera huvudet av det första embryot och placera en fiberoptisk ljuskälla bredvid huvudet. Med hjälp av pigmenterad iris som referenspunkt, penetrera huden, skallen, och cerebral vävnad med spetsen av glaset kapillär och använda munnen pipettering för att underlätta leveransen av 3-5 mikroliter av injektionslösningen i ventrikeln på en av cerebrala halvklot.
Eftersom den injicerade lösningen innehåller 0,1%Fast Green, kommer en lyckad injektion att resultera i en mörkgrön färgning av den injicerade ventrikeln, som nu kommer att synas som en njurformad struktur. Efter injektionen, placera pincettelektroderna på livmodern ovanför embryots huvud med den positiva polen ovanför det område som ska riktas och den negativa polen under det injicerade området. Ställ in pulslängden på elektroporatet till 50 millisekunder, pulsspänningen till 100 volt, pulsintervallet till en sekund och antalet pulser till fem.
När alla parametrar har ställts in, tryck Puls "och snabbt släppa flera droppar av varma PBS på det elektroporerade embryot. När alla embryon har elektroporerats, återgå livmodern till bukhinnan hålighet och använda en 4-0 sutur för att stänga muskelskiktet med bukhinnan. Stäng huden på ett liknande sätt och täck såret med aluminiumspray.
Sedan tillbaka djuret till sin bur med en värmekälla och övervakning tills full recumbency. Fyra dagar efter elektroporation på embryonala dag 37, de flesta av de riktade celler och deras avkomma är fortfarande i de germinal zoner och cellerna sällan observeras ytterligare basalt inom kortikala plattan. Den progenitor identitet kan undersökas genom immunofluoresens för markörer av cykling celler, såsom PCNA, medan en delmängd av progenitorer som genomgår mitos kan visas med markörer såsom phospho-histone 3.
Vid postnatala dag noll, åtta dagar efter elektroporation, sprider sig avkomman av de riktade cellerna till alla histologiska lager. Med hjälp av en kombination av transkriptionsfaktor markörer, kan olika basala stamceller befolkningar avslöjas. Till exempel är Sox2 en markör för proliferativ progenitor celler, inklusive basala radiella glia.
Och T-box hjärnan protein 2 är en markör för neurogena basala stamceller, som huvudsakligen är mellanliggande progenitorer. Genom postnatala dag 16, en majoritet av de riktade cellerna sluta dela och differentiera till nervceller och glia, med iller postnatala dag 16 neocortex uppvisar den karakteristiska vikning mönster. In utero-elektroporation av illerembryon är en extremt kraftfull metod för att studera genernas funktion.
Det har gjort det möjligt för oss att studera gener som har varit inblandade i expansionen av neocortex i evolutionen, inklusive människospecifika gener. Och med hjälp av denna kraftfulla metod har vi verkligen kunnat ta reda på viktiga inslag i hur den evolutionära expansionen av den mänskliga neocortex sannolikt fungerade.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
