Kontinuerlig måling av biologisk støy i Escherichia Coli ved bruk av mikroskopi for tidsforløp

Denne protokollen i urter kontinuerlig måling av genetiske kretser i E.coli og beregning av signalvariabilitet og signal-til-støy-forhold i individuell bakteriell celle for å vurdere kretsytelsen. De viktigste fordelene med denne teknikken er at den lett kan tilpasses forskjellige stammer og laboratorier, krever minimal trening og ikke noe spesialutstyr, og er relativt billig. Støy er en viktig rolle i å bestemme funksjonaliteten til biologiske systemer.

For tiden er det interesse for å bygge store genkretser. Disse systemene kan hemmes av støy Sørg for å tørke prøvene godt, for å holde de chill pads på fire grader Celsius så lenge som mulig, og for å kutte og dele delene tålmodig og forsiktig. For å forberede bakteriene til analysen inokulerer en enkelt koloni fra en transfektert E.coli-kultur.

For eksempel en krets med en GFP-reporter. I et glassrør som inneholder fem milliliter LB kjøttkraft supplerer det med relevante antibiotika. Vokse cellene ved 37 grader Celsius og 250 omdreininger per minutt i en rystende inkubator i to timer til buljongen er overskyet.

På slutten av inkubasjonen, spinn ned en milliliter fortynningsløsning i en to milliliter mini mikro sentrifuge, og overfør 30 mikroliter bakterier og hele volumet av fortynningsløsning til et nytt to milliliterrør. Deretter inkuberer du kulturen i en time med risting før du sådde 40 til 60 mikroliter av denne suspensjonen på M9-kulturplater. For å forberede bakteriene til analysen, inokulere en enkelt koloni fra en transfektert E.Coli-kultur.

For eksempel, en krets med en GFP reporter i et glassrør som inneholder fem milliliter LB kjøttkraft supplert med relevante antibiotika. Vokse cellene ved 37 grader Celsius og 250 omdreininger per minutt i en rystende inkubator i to timer til buljongen er overskyet. På slutten av inkubasjonen, spinn ned en milliliter fortynningsløsning i et to milliliter mini mikrosentrifugerør og overfør 30 mikroliter bakterier og hele volumet av fortynningsløsning til et nytt to milliliterrør.

Inkuber deretter kulturen i en time med risting. For å forberede mikroskopplater, bland 112,5 milligram lav smeltende agar med 40 milligram agar, og en milliliter 2% casaminosyre i en 25 milliliter Erlenmeyer kolbe. Deretter legger du til 8,92 milliliter minimalt medium over de indre leppene til en 25 milliliter Erlenmeyer-kolbe og mikrobølgeovn den resulterende løsningen i korte, to til tre sekunders brister.

Sett deretter vannbadet til 55 grader Celsius. Når løsningen er klar, plasser 25 milliliter Erlenmeyer-kolben i et 60 grader Celsius vannbad og la agarløsningen avkjøles til temperaturen faller til ca. 45 til 50 grader Celsius. Mens agarkjølingen, rengjør laboratoriebenken med 70% etanol og glatt et stykke labtape på den rensede benken.

Sett en glassdekselslipp på tapen og sett en ekstra dekselslipp i nærheten. Tilsett avkjølt agarløsning til riktig antibiotika og løsning. Hell 1,5 milliliter nytilberedt geloppløsning på dekselslippet plassert over båndet og legg den andre dekselslipen på gelen, og pass på å unngå bobler.

Sett Erlenmeyer tilbake til varmtvannsbadet og dekk til dekselet i 20 minutter. Vend dekselet i en times inkubasjon ved fire grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, fjern dekselskliene fra den tørre gelen og kutt en liten pute fra agarose.

Under inkubasjonen legger du til seks mikroliterdråper av den tilberedte bakterielle suspensjonen i en 35 millimeter tallerken og lar dråpene tørke i minst 15 til 30 minutter. Plasser deretter puten om gangen forsiktig på en dråpe bakterier og la prøvene stilles inn i 20 minutter ved romtemperatur. For å plassere agarsengen uten å smøre prøven, plasser forsiktig kjøleputen på dråpen med forsiktig tapping.

For å avbilde prøvene, fjern kolben fra vannet og la gelløsningen avkjøles til kroppstemperatur. Hell tre millimeter gel på omkretsen av prøveplaten. Når agarose har størknet, forsegle platen med tape og bruk en 25 gauge nål til å stykke flere hull i båndet.

Plasser deretter platen opp ned ved fire grader Celsius i minst 30 minutter for å la agarose fullt størkne, samtidig som du forhindrer cellemittose. Innen 24 timer, bruk et fluorescens konfokalt mikroskop for å finne prøven ved laveste forstørrelse og engasjere mikroskopets automatiske fokussystem. Påfør olje på riktig mål og bruk plattformkontrolleren til å flytte platen for å spre oljen forsiktig.

Deretter engasjerer du det automatiske fokuset igjen og følger standardforslaget for Z-trinns tverrsnitt for å avbilde prøven. E.coli skal vises som svarte avlange former på en off white bakgrunn. Og det dynamiske spekteret av lysstyrken skal vise en spike i midten.

Mitosehendelser kan først oppdages ved fluorescensmikroskopi etter 30 minutter. Selv om enkeltceller kan være vanskelige å oppdage ved lav forstørrelse. Bakterielle cellekulturer utarbeidet ved feil fortynningsforhold kan demonstrere uendret antall celler, og prøver utarbeidet uten plateforsegling kan vise overdreven krymping, noe som resulterer i tap av fokus.

Celler kan også rykke inn gelen i søket etter næringsstoffer, noe som resulterer i stabling av bakteriecellene oppå hverandre og kompromittere cellemonolayeren, og forhindrer effektivt celledeteksjon og pålitelig fluorescerende signalmåling. Som antydet av disse dataene, påvirker ikke celletrinnet i divisjonssyklusen støynivået, da forskjellige områdeområder viser den samme trenden. Videre observeres ingen vesentlig endring i signal-til-støy-forholdet mellom GFP og superfold GFP, som illustrert av disse representative dataene.

Når du utfører denne prosedyren, må du passe på å bestemme riktig fortynningsforhold for bakteriestammen som brukes til eksperimentet. Sammenligning av signal-til-støy-forholdet mellom hver regulerte kretser med denne baselinjen tillater valg av den beste ytelseskretsen og kan avsløre interessante fenomener