Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Kontinuerlig måling af biologisk støj i Escherichia Coli ved hjælp af time-lapse mikroskopi
Chapters
Summary April 27th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Dette arbejde præsenterer en mikroskopi metode, der tillader levende billeddannelse af en enkelt celle af Escherichia coli til analyse og kvantificering af stokastisk adfærd syntetiske gen kredsløb.
Transcript
Denne protokol i naturlægemidler kontinuerlig måling af genetiske kredsløb i E.coli og beregning af signalvariationen og signal-til-støj-forholdet i individuelle bakterieceller for at vurdere kredsløbets ydeevne. De vigtigste fordele ved denne teknik er, at den let kan tilpasses forskellige stammer og laboratorier, kræver minimal træning og intet specielt udstyr og er relativt billigt. Støj er en væsentlig rolle i fastlæggelsen af funktionaliteten af biologiske systemer.
I øjeblikket er der en interesse i at bygge store genkredsløb. Disse systemer kan hæmmes af støj Sørg for at tørre prøverne godt, for at holde chill pads ved fire grader Celsius så længe som muligt, og for at skære og opdele delene tålmodigt og forsigtigt. At forberede bakterierne til analysen vaccinere en enkelt koloni fra en transfected E.coli kultur.
For eksempel et kredsløb med en GFP reporter. I et glasrør, der indeholder fem milliliter LB bouillon supplere det med de relevante antibiotika. Vokse cellerne ved 37 grader Celsius og 250 omdrejninger i minuttet i en rystende inkubator i to timer, indtil bouillon er overskyet.
Ved afslutningen af inkubationen skal du dreje en milliliter fortyndingsopløsning ned i en to milliliter mini mikrocentrifuge og overføre 30 mikroliter bakterier og hele mængden af fortyndingsopløsning til et nyt to milliliterrør. Derefter inkuberes kulturen i en time med rysten, før du sår 40 til 60 mikroliter af denne suspension på M9-kulturplader. For at forberede bakterierne til analysen skal du vaccinere en enkelt koloni fra en transfected E.Coli-kultur.
For eksempel et kredsløb med en GFP reporter i et glasrør, der indeholder fem milliliter LB bouillon suppleret med de relevante antibiotika. Vokse cellerne ved 37 grader Celsius og 250 omdrejninger i minuttet i en rystende inkubator i to timer, indtil bouillon er overskyet. Ved afslutningen af inkubationen skal du dreje en milliliter fortyndingsopløsning ned i et to milliliter mini mikrocentrifugerør og overføre 30 mikroliter bakterier og hele mængden af fortyndingsopløsning til et nyt to milliliterrør.
Derefter inkubere kulturen i en time med rysten. For at forberede mikroskopplader blandes 112,5 milligram lav smeltende agar med 40 milligram agar og en milliliter 2%casaminosyre i en 25 milliliter Erlenmeyer kolbe. Dernæst tilsættes 8,92 milliliter minimal medium over de indre læber af en 25 milliliter Erlenmeyer kolbe og mikrobølgeovn den resulterende opløsning i korte, to til tre sekunder brister.
Sæt derefter vandbadet til 55 grader Celsius. Når opløsningen er klar, skal du placere 25 milliliter Erlenmeyer kolben i et 60 grader Celsius vandbad og lad agaropløsningen køle af, indtil temperaturen falder til ca. 45 til 50 grader Celsius. Mens agarkøling, rengør lab bænken med 70% ethanol og glat et stykke lab tape på den rensede bænk.
Placer et glasdæksel slip på båndet og placere en anden dækning slip i nærheden. Tilsæt afkølet agaropløsning til de relevante antibiotika og opløsning. Hæld 1,5 milliliter frisklavet til gelopløsning på dækslet glide placeret over båndet og læg det andet dæksel glide på gelen, idet man sørger for at undgå bobler.
Returner Erlenmeyer til varmtvandsbadet og dæk dækslet i 20 minutter. Vend dækslet glider i en times inkubation ved fire grader Celsius. I slutningen af inkubationen fjernes dækslet fra den tørre gel og skæres en lille pude fra agarose.
Under inkubationen tilsættes seks mikroliterdråber af den forberedte bakteriele suspension i en 35 millimeter skål og lad dråberne tørre i mindst 15 til 30 minutter. Placer derefter forsigtigt puden ad gangen på en dråbe bakterier og lad prøverne indstille i 20 minutter ved stuetemperatur. Hvis du vil placere agarbunden uden at smøre prøven, skal du forsigtigt placere den kølige pude på dråben med skånsomt tryk.
For at afbilde prøverne skal du fjerne kolben fra vandet og lade gelopløsningen køle af til kropstemperaturen. Hæld tre millimeter af gelen på prøvepladens omkreds. Når agarose har størknet, forsegle pladen med tape og bruge en 25 gauge nål til at stykke flere huller i båndet.
Placer derefter pladen på hovedet ved fire grader Celsius i mindst 30 minutter for at lade agarose fuldt størkne, samtidig med at cellemideose forhindres. Inden for 24 timer skal du bruge et fluorescenskonfokalt mikroskop til at lokalisere prøven ved den laveste forstørrelse og engagere mikroskopets automatiske fokussystem. Påfør olie til det relevante mål, og brug platformcontrolleren til at flytte pladen for omhyggeligt at sprede olien.
Derefter engagere den automatiske fokus igen og følg standardforslaget til Z trin tværsnit for at billedet prøven. E.coli skal fremstå som sorte aflange former på en ikke-hvid baggrund. Og det dynamiske område af luminansen skal vise en stigning i midten.
Mitosehændelser kan først påvises ved fluorescensmikroskopi efter 30 minutter. Selvom individuelle celler kan være svære at opdage ved lav forstørrelse. Bakteriecellekulturer, der er udarbejdet ved et forkert fortyndingsforhold, kan påvise uændrede antal celler, og prøver, der er tilberedt uden pladeforsegling, kan udvise overdreven krympning, hvilket resulterer i tab af fokus.
Celler kan også indrykke gelen i deres søgen efter næringsstoffer, hvilket resulterer i stabling af bakteriecellerne oven på hinanden og kompromittere cellens monolayer, hvilket effektivt forhindrer celledetektion og pålidelig fluorescerende signalmåling. Som foreslået af disse data påvirker cellestadiet i opdelingscyklussen ikke støjniveauet, da forskellige områdeområder viser den samme tendens. Desuden observeres der ingen væsentlig ændring i signal-til-støj-forholdet mellem GFP og superfoldig GFP, som det fremgår af disse repræsentative data.
Når du udfører denne procedure, skal du sørge for at bestemme det korrekte fortyndingsforhold for den bakteriestamme, der bruges til forsøget. Sammenligning af signal-til-støj-forholdet for hvert reguleret kredsløb til denne basislinje giver mulighed for valg af det bedste ydelseskredsløb og kan afsløre interessante fænomener
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
