Bioengineering
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Misurazione continua del rumore biologico in Escherichia Coli utilizzando la microscopia time-lapse
Chapters
Summary April 27th, 2021
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Questo lavoro presenta un metodo di microscopia che consente l'imaging vivo di una singola cellula di Escherichia coli per l'analisi e la quantificazione del comportamento stocastico dei circuiti genetici sintetici.
Transcript
Questo protocollo nelle erbe misura continua dei circuiti genetici in E.coli e il calcolo della variabilità del segnale e del rapporto segnale-rumore nelle singole cellule batteriche per valutare le prestazioni del circuito. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è facilmente adattabile a diversi ceppi e laboratori, richiede un allenamento minimo e nessuna attrezzatura speciale ed è relativamente economico. Il rumore è un ruolo significativo nel determinare la funzionalità dei sistemi biologici.
Attualmente, c'è interesse a costruire circuiti genetici su larga scala. Questi sistemi possono essere inibiti dal rumore Assicurarsi di asciugare bene i campioni, di mantenere i tamponi a freddo a quattro gradi Celsius il più a lungo possibile e di tagliare e dividere le parti con pazienza e delicatezza. Per preparare i batteri per l'analisi inoculare una singola colonia da una coltura E.coli trasfettata.
Ad esempio, un circuito con un reporter GFP. In un tubo di vetro contenente cinque millilitri di brodo LB completarlo con gli antibiotici pertinenti. Far crescere le cellule a 37 gradi Celsius e 250 giri al minuto in un'incubatrice di scuotimento per due ore fino a quando il brodo non è torbido.
Al termine dell'incubazione, spingi un millilitro di soluzione di diluizione in una mini micro centrifuga da due millilitri e trasferisci 30 microlitri di batteri e l'intero volume della soluzione di diluizione in un nuovo tubo da due millilitri. Quindi, incubare la coltura per un'ora con tremori prima di seminare da 40 a 60 microlitri di questa sospensione su piastre di coltura M9. Per preparare i batteri per l'analisi, inoculare una singola colonia da una coltura E.Coli trasfettata.
Ad esempio, un circuito con un reporter GFP in un tubo di vetro contenente cinque millilitri di brodo LB integrati con gli antibiotici pertinenti. Far crescere le cellule a 37 gradi Celsius e 250 giri al minuto in un'incubatrice di scuotimento per due ore fino a quando il brodo non è torbido. Al termine dell'incubazione, far scendere un millilitro di soluzione di diluizione in un mini tubo di micro centrifuga a due millilitri e trasferire 30 microlitri di batteri e l'intero volume della soluzione di diluizione in un nuovo tubo da due millilitri.
Quindi incubare la coltura per un'ora con tremori. Per preparare lastre al microscopio, mescolare 112,5 milligrammi di agar a bassa fusione con 40 milligrammi di agar e un millilitro di 2%casaminoacido in un pallone Erlenmeyer da 25 millilitri. Successivamente, aggiungere 8,92 millilitri di mezzo minimo sulle labbra interne di un pallone Erlenmeyer da 25 millilitri e microonde la soluzione risultante in brevi raffiche da due a tre secondi.
Quindi impostare il bagno d'acqua a 55 gradi Celsius. Quando la soluzione è chiara, posizionare il pallone Erlenmeyer da 25 millilitri in un bagno d'acqua di 60 gradi Celsius e lasciare raffreddare la soluzione di agar fino a quando la sua temperatura scende a circa 45-50 gradi Celsius. Durante il raffreddamento dell'agar, pulire il banco da laboratorio con il 70% di etanolo e lisciare un pezzo di nastro da laboratorio sulla panca pulita.
Posizionare una copertura di vetro scivolare sul nastro e posizionare un secondo coperchio scivolare nelle vicinanze. Aggiungere la soluzione di agar raffreddata agli antibiotici e alla soluzione appropriati. Versare 1,5 millilitri di soluzione di gel appena preparata sul coperchio del nastro e posizionare il secondo coperchio scivolare sul gel, facendo attenzione ad evitare bolle.
Riportare l'Erlenmeyer al bagno di acqua calda e coprire le copertine per 20 minuti. Capovolgere la copertura scivola per un'incubazione di un'ora a quattro gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, rimuovere i coperchi dal gel secco e tagliare un piccolo tampone dall'agarosio.
Durante l'incubazione, aggiungere sei goccioline di microlitri della sospensione batterica preparata in un piatto da 35 millimetri e lasciare asciugare le gocce per almeno 15-30 minuti. Quindi posizionare con cura il pad alla volta su una goccia di batteri e consentire ai campioni di impostare per 20 minuti a temperatura ambiente. Per posizionare il letto di agar senza spalmare il campione, posizionare con cura il cuscinetto fresco sulla goccia con una delicata maschiatura.
Per immaginire i campioni, rimuovere il pallone dall'acqua e lasciare raffreddare la soluzione di gel alla temperatura corporea. Versare tre millimetri del gel sul perimetro della piastra del campione. Quando l'agarosio si è solidificato, sigillare la piastra con nastro adesivo e utilizzare un ago calibro 25 per infilare diversi fori nel nastro.
Quindi posizionare la piastra capovolta a quattro gradi Celsius per almeno 30 minuti per consentire all'agarosio di solidificarsi completamente, prevenendo al contempo la mitosi cellulare. Entro 24 ore, utilizzare un microscopio confocale a fluorescenza per localizzare il campione all'ingrandimento più basso e attivare il sistema di messa a fuoco automatica del microscopio. Applicare l'olio sull'obiettivo appropriato e utilizzare il controller della piattaforma per spostare la piastra per stendere con cura l'olio.
Quindi attivare nuovamente lo stato attivo automatico e seguire il suggerimento predefinito per le sezioni trasversali del passaggio Z per l'immagine dell'esempio. L'E.coli dovrebbe apparire come forme oblunghe nere su uno sfondo bianco nevroico. E la gamma dinamica della luminanza dovrebbe mostrare un picco al centro.
Gli eventi di mitosi possono essere rilevati per la prima volta dalla microscopia a fluorescenza dopo 30 minuti. Sebbene le singole celle possano essere difficili da rilevare a basso ingrandimento. Le colture cellulari batteriche preparate con un rapporto di diluizione errato possono dimostrare un numero immutabile di cellule e i campioni preparati senza tenuta delle lastre possono presentare un eccessivo restringimento, con conseguente perdita di messa a fuoco.
Le cellule possono anche indentare il gel nella loro ricerca di nutrienti, con conseguente impilamento delle cellule batteriche l'una sopra l'altra e compromettendo il monostrato cellulare, prevenendo efficacemente il rilevamento cellulare e la misurazione affidabile del segnale fluorescente. Come suggerito da questi dati, lo stadio della cella nel ciclo di divisione non influisce sul livello di rumore, poiché diversi intervalli di area dimostrano la stessa tendenza. Inoltre, non si osserva alcuna modifica sostanziale del rapporto segnale/rumore tra GFP e FPG superfold, come illustrato da questi dati rappresentativi.
Quando si esegue questa procedura, fare attenzione a determinare il corretto rapporto di diluizione per il ceppo batterico utilizzato per l'esperimento. Il confronto tra il rapporto segnale/rumore di ogni circuito regolato con questa linea di base consente di scegliere il miglior circuito di prestazioni e può rivelare fenomeni interessanti
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