Biology
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Etablering og vedligeholdelse af gnotobiotiske amerikanske kakerlakker (Periplaneta americana)
Chapters
Summary May 28th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne protokol anvendes til at etablere og vedligeholde gnotobiotiske amerikanske kakerlakker (Periplaneta americana) ved overfladesterilisering af ægkasserne (oothecae) før udklækning. Disse gnotobiotiske insekter indeholder deres lodret overførte Blattabacterium endosymbionts, men har økse indvolde.
Transcript
Den gnotobiotiske kakerlakgenerationsprotokol letter test af virkningen af indfødte tarmmikrobielle samfund fjernelse og udskiftning på værtssundhed og mikrobiommontering. Denne teknik bruger metoder fra flere kilder til at danne en sammenhængende, strømlinet arbejdsgang til generering af gnotobiotiske kakerlakker uden brug af dyrt speciallaboratorieudstyr. I betragtning af de mange forskellige bevægelige dele af denne gnotobiotiske protokol hjælper visualisering forskere med lettere at etablere deres egne små, billige, bænk-top gnotobiotiske faciliteter.
For at lette indsamlingen af det passende antal hunner, der bærer oothecae til de planlagte forsøg, skal du bruge pincet til at flytte paprørene, der indeholder gravide hunner i lagertanken. Hvis et paprør indeholder flere insekter ud over den gravide kvinde, ryst rørindholdet i en ekstra plastbeholder, der er ringet med vaseline, og opfordr målinsektet til at klatre tilbage i paprøret alene. Ved indsamlingen overføres hver gravid kvinde til fødeafdelingen.
Når hunnerne har tabt deres oothecae, returnere hunnerne til bestanden tanken og bruge pincet til at hente oothecae fra kuldet. For at rengøre oothecae, sted op til fem æg tilfælde i en fem-milliliter centrifuge rør, der indeholder tre milliliter natrium dodecyl sulfat og vortex oothecae i 10 sekunder. Efter en anden vask som netop demonstreret, skal du bruge en delikat opgave tørre til forsigtigt skrubbe overfladen af hver ootheca at fjerne snavs og placere den rensede ootheca i en vægt båd.
Før sterilisering fyldes to 1,5 milliliter centrifugerør pr. ootheca med en milliliter sterilt vand pr. Rør. Der tilsættes også 10 mikroliter af 32% peracetisk syre lageropløsning til 3,2 milliliter dobbeltdestilleret vand i et fem-milliliter centrifugerør i en røghætte. Cap og invertere flere gange for at blande og placere op til fem rensede oothecae i frisklavet 0,1% peracetisk syreopløsning i fem minutter, invertere røret flere gange hvert 60 sekund.
Perdikesyre er en stærk oxidator et øje, hud og luftvejsirriterende, og er brandfarlig og ætsende. Brug altid den rigtige PERSONLIGE VÆRN under håndtering og bortskaffe dit affald korrekt. Ved afslutningen af inkubationen skal du bruge sterile pincet og en laminar flow hætte til at overføre hver ootheca til sit eget centrifugerør af sterilt skyllevand.
Inverter flere gange for at blande, før du overfører oothecae til det andet sæt rør af skyllevand. Efter den anden skylning skal du bruge sterile pincet til at overføre oothecae til individuelle BHI-skråninger. Placer skråningerne i en steriliseret sekundær beholder og flyt beholderen til en befugtet 30-graders Celsius inkubator i fire til fem uger, indtil udklækket.
Kontroller skråningerne regelmæssigt en til to gange om ugen for svampe- eller bakterievækst indtil den fjerde uge, hvorefter skråningerne skal kontrolleres dagligt. Når nymferne begynder at klække, skal du bruge sterile pincet og en laminar flow hætte til aseptisk overføre en pellet af steriliseret rotte chow til en forberedt BHI kolbe. Som sterilitetskontrol skal kolben placeres i den sekundære beholder i 30-graders Celsius-inkubatoren i 24 timer for at bekræfte manglende kontaminerende vækst.
Hvis kolben er forblevet steril, rystes nymferne ud af skråningen og lader dem falde i kolben i laminar flowhætten. Vand derefter nymferne med 300 mikroliter sterilt vand en gang om ugen i laminar flowhætten. Når nymfeafføring begynder at dække mellemgulvet, skal nymferne overføres til en ny BHI-kolbe, der indeholder steriliseret rotte chow, der er tilføjet 24 timer i forvejen, som påvist.
Gravide kvinder kan identificeres ved ootheca knyttet til deres bageste maver. Oothecae lugen i gennemsnit 34 dage efter sterilisering. I tilfælde af mislykket sterilisering kan der forekomme vækst omkring oothecae under inkubationen, der kompromitterer hatchlingernes gnotobiotiske status.
Derefter kan nymphal vækstrate spores ved at måle insektkroppens længde. Begrænsning fragment længde polymorfi af 16S ribosomal DNA fra en homogeniseret nymfe kan bruges til at bekræfte gnotobiotiske status. Gnotobiotiske kakerlakker kan podes med syntetiske eller xenobiotiske mikrobielle samfund.
Mens denne særlige arbejdsgang er ny, har tidligere undersøgelser ved hjælp af gnotobiotiske kakerlakker genereret indsigt i tarmmikrobieforsamling og mikrobielle roller i udformningen af social adfærd, tarmsundhed og immunitet for deres insektværter.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.