Biology
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Etablering og vedlikehold av Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)
Chapters
Summary May 28th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne protokollen brukes til å etablere og vedlikeholde gnotobiotiske amerikanske (Periplaneta americana) ved overflatesterilisering av eggkassene (oothecae) før klekking. Disse gnotobiotiske insekter inneholder sine vertikalt overførte Blattabacterium endosymbionts, men har akseniske tarmer.
Transcript
Den gnotobiotiske kakerlakkgenereringsprotokollen letter testing av virkningen av innfødt tarmmikrobiell fjerning og erstatning på vertshelse og mikrobiomemontering. Denne teknikken bruker metoder fra flere kilder for å danne en sammenhengende, strømlinjeformet arbeidsflyt for å generere gnotobiotiske uten bruk av dyrt spesiallaboratoriumsutstyr. Med tanke på de mange forskjellige bevegelige delene av denne gnotobiotiske protokollen, hjelper visualisering forskere lettere å etablere sine egne småskala, billige, benk-topp gnotobiotiske anlegg.
For å lette innsamlingen av riktig antall kvinner som bærer oothecae for de planlagte forsøkene, bruk tang til å flytte papprørene som inneholder gravide kvinner i lagertanken. Hvis et papprør inneholder flere insekter i tillegg til gravid-kvinnen, rist rørinnholdet i en ekstra plastbeholder ringet med petroleumjell og oppmuntre målinsektet til å klatre tilbake i papprøret alene. Ved innsamling, overføre hver gravid kvinne inn i barselavdelingen.
Når hunnene har droppet oothecae, returner hunnene til lagertanken og bruk tang for å hente oothecae fra søppelet. For å rengjøre oothecae, plasser opptil fem eggkasser i et fem milliliter sentrifugerør som inneholder tre milliliter natriumdodecylsulfat og virvel oothecae i 10 sekunder. Etter en ny vask som nettopp demonstrert, bruk en delikat oppgaveserviett for å forsiktig skrubbe overflaten av hver ootheca for å fjerne rusk og plassere den rensede oothecaen i en veiebåt.
Før sterilisering, fyll to 1,5 milliliter sentrifugerør per ootheca med en milliliter sterilt vann per rør. Tilsett også 10 mikroliter 32% peracetic acid lagerløsning til 3,2 milliliter dobbeltdestillert vann i et fem milliliter sentrifugerør i en avtrekkshette. Cap og invertere flere ganger for å blande og plassere opptil fem rengjort oothecae i den nylagde 0,1% peracetic acid løsning i fem minutter, invertere røret flere ganger hvert 60 sekund.
Peracetic acid er en sterk oksidasjonsmiddel et øye, hud og respiratorisk irriterende, og er brannfarlig og etsende. Bruk alltid riktig verneutstyr under håndtering og kast avfallet på riktig måte. På slutten av inkubasjonen, bruk sterile tang og en laminær strømningshette for å overføre hver ootheca til sitt eget sentrifugerør med sterilt skyllevann.
Snu flere ganger for å blande før du overfører oothecae til det andre settet med rør med skyllevann. Etter den andre skyllingen, bruk sterile tang for å overføre oothecae til individuelle BHI skråblikk. Plasser skråningene i en sterilisert sekundærbeholder og flytt beholderen inn i en fuktet 30-graders Celsius inkubator i fire til fem uker til den klekkes.
Kontroller skråstillingene regelmessig en til to ganger i uken for sopp- eller bakterievekst til den fjerde uken, og da bør skråningene kontrolleres daglig. Når nymfene begynner å klekkes, bruk sterile tang og en laminær strømningshette for å overføre en pellets av sterilisert rotte chow til en forberedt BHI-kolbe. Som en sterilitetskontroll, plasser kolben i sekundærbeholderen i 30-graders Celsius-inkubatoren i 24 timer for å bekrefte mangel på forurensende vekst.
Hvis kolben har forblitt steril, rist nymfene ut av skråningen, la dem falle inn i kolben i laminærstrømningshetten. Vann deretter nymfene med 300 mikroliter sterilt vann en gang i uken i laminær strømningshette. Når nymfe avføring begynner å dekke mellomgulvet, overfør nymfene til en ny BHI-kolbe som inneholder sterilisert rotte chow lagt til 24 timer i forveien, som demonstrert.
Gravide kvinner kan identifiseres av ootheca festet til deres bakre underliv. Oothecae luker i gjennomsnitt 34 dager etter sterilisering. I tilfeller av mislykket sterilisering kan veksten oppstå rundt oothecae under inkubasjonen, og kompromittere gnotobiotisk status for hatchlings.
Deretter kan nymphal vekstrate spores ved å måle insektets kroppslengde. Begrensning fragment lengde polymorfisme av 16S ribosomal DNA fra en homogenisert nymfe kan brukes til å bekrefte gnotobiotisk status. Gnotobiotiske kan inokuleres med syntetiske eller xenobiotiske mikrobielle samfunn.
Selv om denne spesielle arbeidsflyten er ny, har tidligere studier ved hjelp av gnotobiotiske generert innsikt i tarmmikrobiomemontering og mikrobielle roller i å forme sosial atferd, tarmhelse og immunitet hos sine insektverter.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
