Neuroscience
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राइनल कॉर्टेक्स-हिप्पोकैम्पस ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस संस्कृतियों में मिर्गी का एक मॉडल
Chapters
Summary March 18th, 2021
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यहां, हम राइनल कॉर्टेक्स-हिप्पोकैम्पस ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस की तैयारी का वर्णन करते हैं। सीरम के क्रमिक और नियंत्रित अभाव के तहत, ये स्लाइस मिर्गी जैसी घटनाओं को चित्रित करते हैं और मिर्गी के पूर्व वीवो मॉडल को माना जा सकता है। यह प्रणाली सहज गतिविधि की गतिशीलता की निगरानी के साथ-साथ मिर्गी के दौरान न्यूरोइंफ्लैमेटरी सुविधाओं की प्रगति का आकलन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण का प्रतिनिधित्व करती है।
Transcript
मिर्गी एक प्रचलित न्यूरोलॉजिकल बीमारी है। राइनल कॉर्टेक्स-हिप्पोकैम्पस ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस विकसित मिर्गी जैसी घटनाओं को दर्शाते हैं जो वीवो मिर्गी में समान होते हैं और इसलिए मिर्गी के पूर्व वीवो मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। यह प्रणाली वास्तव में मिर्गी की गतिशीलता और प्रगति की निगरानी के साथ-साथ इस मस्तिष्क विकृति के लिए संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की स्क्रीनिंग के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है।
मेरे साथ प्रक्रियाओं का प्रदर्शन मेरे छात्रों फ्रांसिस्को मेडा और Mafalda कार्वाल्हो होगा । एक प्रसवोत्तर दिन छह से सात Sprague-Dawley पिल्ला से मस्तिष्क फसल के लिए, पहले जीबीएस के पांच मिलीलीटर में तीन बार सिर धोने । एक जैवसेफ्टी कैबिनेट में काम करना, सिर को पकड़ने के लिए आंखों की कुर्सियां में तेज संदंश डालें और कशेरुकी फोरमेन से ललाट लोब्स तक मिडलाइन के साथ खोपड़ी को काटने के लिए पतली टिप कैंची का उपयोग करें।
खोपड़ी को उसी तरीके से और सेरेब्रल ट्रांसवर्स फिशर के साथ काटें और खोपड़ी के टुकड़ों को अलग करने के लिए घुमावदार लंबे संदंश का उपयोग करें। घ्राण बल्बों को त्यागने के लिए और मस्तिष्क पृष्ठीय पक्ष को 60 मिलीमीटर प्लेट में स्थानांतरित करने के लिए एक स्पैटुला का उपयोग करें जिसमें पांच मिलीलीटर ठंडे जीबीएसएस शामिल हैं। सेरिबैलम में ठीक संदंश डालें और गोलार्द्ध को ध्यान से खोलने के लिए मिडलाइन के साथ स्पैटुला डालें।
हिप्पोकैम्पस संरचना को छूने के बिना हिप्पोकैम्पस को कवर करने वाले अतिरिक्त ऊतक को ध्यान से हटाने के लिए छोटे घुमावदार संदंश का उपयोग करें, फिर प्रत्येक हिप्पोकैम्पस के नीचे काटें। एक समय हिप्पोकैम्पस साइड में एक गोलार्द्ध को फ़िल्टर पेपर के एक टुकड़े पर एक दूसरे के समानांतर स्थानांतरित करें। फिल्टर पेपर को एक ऊतक हेलिकॉप्टर पर एक ऊतक हेलिकॉप्टर पर रखें जिसमें गोलार्द्धों को ब्लेड के लंबवत किया जाता है और गोलार्द्धों को 350 माइक्रोन स्लाइस में काट दिया जाता है।
कटा हुआ ऊतक को एक नए पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें पांच मिलीलीटर ठंडे जीबीएसएस होते हैं और संरचनात्मक रूप से बरकरार राइनल कॉर्टेक्स और हिप्पोकैम्पस के साथ केवल नमूनों को ध्यान से रखने के लिए गोल टिप इलेक्ट्रोड का उपयोग करते हैं। डीजी और सीए क्षेत्रों को पूरी तरह से परिभाषित किया जाना चाहिए और साथ ही एंटोराइनल और पेरिहिनल कॉर्टेक्स क्षेत्रों को भी परिभाषित किया जाना चाहिए । एक स्पैटुला और एक गोल टिप इलेक्ट्रोड का उपयोग करें ताकि छह-अच्छी तरह से प्लेट के कुओं की उचित संख्या में व्यक्तिगत आवेषण पर चार अक्षुण्ण स्लाइस तक रखें, जिसमें संस्कृति माध्यम के 1.1 मिलीलीटर शामिल हैं।
प्रत्येक स्लाइस के चारों ओर से किसी भी अतिरिक्त विच्छेदन माध्यम को हटाने के लिए एक P20 पिपेट का उपयोग करें। प्लेट को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखें। हर दो से तीन दिन में माध्यम बदलें।
डालने को उठाने के लिए संदंश का उपयोग करें। माध्यम को संबंधित अच्छी तरह से एएसपिरेट करें और डालने को वापस रखें। प्रत्येक अच्छी तरह से ताजा 37 डिग्री सेल्सियस माध्यम के एक मिलीलीटर जोड़ने के लिए एक P1000 पिपेट का उपयोग करें।
एक बंद सर्किट में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सेटअप तैयार करें। सत्यापित करें कि इंटरफ़ेस प्रकार कक्ष की प्रवाह दर प्रति मिनट दो मिलीलीटर के लिए सेट है और कार्ब-ऑक्स वाल्व खोलें। सिस्टम में जल स्तर की जांच करें और किसी भी अतिरिक्त माध्यम को निकालने के लिए इंटरफ़ेस रिकॉर्डिंग कक्ष में फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा रखें।
स्लाइस को माध्यम की आपूर्ति करने के लिए फ्रेम के नीचे लेंस सफाई कागज का एक टुकड़ा रखें और तापमान नियंत्रक, एम्पलीफायर और माइक्रो जोड़तोड़ चालू करें। ताजा तैयार कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ के साथ एक ग्लास इलेक्ट्रोड लोड करने के लिए एक सिरिंज का उपयोग करें। ग्लास इलेक्ट्रोड को प्राप्त करने वाले इलेक्ट्रोड में रखें और 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर होने के लिए इंटरफ़ेस कक्ष में तापमान की प्रतीक्षा करें।
एक जैवसेफ्टी कैबिनेट में काम करते हुए, माध्यम की एक बूंद के साथ 60 मिलीमीटर प्लेट में डालें रखें। डालने से एक टुकड़ा काटने के लिए एक तेज ब्लेड का उपयोग करें और नीचे दाईं ओर हिप्पोकैम्पस के साथ इंटरफेस चैंबर में टुकड़ा जगह है, तो CA3 पिरामिड सेल परत में प्राप्त इलेक्ट्रोड जगह है, निरंतर अधिग्रहण प्रोटोकॉल शुरू, और 30 मिनट के लिए टुकड़ा रिकॉर्ड । प्रोपिडियम आयोडाइड तेज परख करने के लिए, एक जैवसेफ्टी कैबिनेट में काम करते हैं।
डालने को अच्छी तरह से उठाएं और मध्यम में प्रोपिडियम आयोडाइड को दो माइक्रोमोलर प्रति अच्छी तरह से अंतिम एकाग्रता में जोड़ें। धीरे-धीरे डालने को अच्छी तरह से वापस रखने से पहले प्लेट को उत्तेजित करें, इस बात का ध्यान रखें कि स्लाइस के नीचे कोई बुलबुले न हों। जब सभी स्लाइस का इलाज किया गया है, सेल संस्कृति इनक्यूबेटर के लिए थाली वापस ।
स्लाइस के इम्यूनोशेटिंग के लिए, प्रोपिडियम आयोडाइड इनक्यूबेशन के अंत में, प्रत्येक कुएं के नीचे से माध्यम को बढ़ाएं और प्रत्येक डालने के ऊपर और नीचे 4% पैराफॉर्मलडिहाइड का एक मिलीलीटर जोड़ें। कमरे के तापमान पर एक घंटे के बाद, स्लाइस को 10 मिनट के लिए दो बार धोएं और प्रति वॉश पीबीएस के एक मिलीलीटर और माइक्रोस्कोप स्लाइड पर दो आयतों को आकर्षित करने के लिए हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग करें। आवेषण से स्लाइस को काटने के लिए एक तेज ब्लेड का उपयोग करें और प्रत्येक आयत में एक टुकड़ा रखें।
कमरे के तापमान पर तीन घंटे की इनक्यूबेशन के लिए प्रत्येक स्लाइस पर पारमेबिलाइजेशन अवरुद्ध समाधान जोड़ें। इनक्यूबेशन के अंत में, एक चार डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेशन रात के लिए प्रत्येक टुकड़ा करने के लिए ब्याज की प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें । अगली सुबह, PBS-Tween के साथ स्लाइस धोने के प्रति धोने के प्रति 10 मिनट के लिए तीन बार और कमरे के तापमान पर चार घंटे के लिए उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ स्लाइस इनक्यूबेट ।
बाद में, स्लाइस को धोएं जैसा कि प्रदर्शन किया गया है और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के इनक्यूबेशन के लिए प्रत्येक स्लाइस में 50 माइक्रोलीटर होचस्ट समाधान जोड़ें। Hoechst इनक्यूबेशन के बाद, स्लाइस को फिर से धोएं और हर एक में बढ़ते माध्यम के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें, फिर स्लाइस पर एक कवरलिप रखें और नेल पॉलिश के साथ सील करें। स्लाइड को कमरे के तापमान पर 24 घंटे तक सूखने की अनुमति देने के बाद, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा इम्यूनोस्टेटिंग और प्रोपिडियम आयोडाइड तेज की कल्पना करें।
राइनल कॉर्टेक्स-हिप्पोकैम्पस ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस विट्रो में सात दिनों में मिश्रित इंटरिकल और आईसीटील जैसी गतिविधि को दर्शाते हैं। विट्रो में 14 दिनों में, सहज गतिविधि को आईसीटील डिस्चार्ज की विशेषता है, जो एक मिनट से अधिक समय तक चलने वाली आईसीटील घटनाओं के साथ विट्रो में 21 दिनों में एक भारी आईसीटील गतिविधि के लिए विकसित होती है। न्यूरोनल मार्कर न्यून के खिलाफ प्रोपिडियम आयोडाइड तेज और इम्यूनोथिस्टोकेमिस्ट्री ने विट्रो स्लाइस में सात दिनों में कुछ न्यूरोनल डेथ का खुलासा किया जो हिप्पोकैम्पस के सभी क्षेत्रों में विट्रो में 14 दिनों में काफी बढ़ जाता है।
विट्रो में सात दिनों में, कम सीडी 68 अभिव्यक्ति के साथ रैमिफाइड माइक्रोग्लिया Iba1 सकारात्मक सीडी 68 सकारात्मक प्रतिक्रियाशील माइक्रोग्लिया की तुलना में अधिक प्रचुर मात्रा में हैं। जबकि विट्रो में 14 दिनों में, हिप्पोकैम्पस के सभी क्षेत्रों में, Iba1 सकारात्मक सीडी 68 सकारात्मक अमोइबाय M1 माइक्रोग्लिया कम सीडी 68 अभिव्यक्ति के साथ माइक्रोग्लिया से अधिक है। विट्रो में 14 दिनों में, हाइपर असर उपस्थिति के साथ कुछ आईबीए 1 सकारात्मक सीडी 68 सकारात्मक कोशिकाओं को इंगित किया जा सकता है, जो एम 2 विरोधी भड़काऊ माइक्रोग्लिया फेनोटाइप की संभावना का सुझाव देता है।
विट्रो में सात दिनों में, सीडी 3 की अभिव्यक्ति मुश्किल से पता लगाने योग्य है, जबकि 14 दिन में विट्रो स्लाइस, हाइपरट्रोफिक ग्लियल फिब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन सकारात्मक सीडी 3 सकारात्मक एस्ट्रोसाइट्स देखा जा सकता है, जो A1 एस्ट्रोसाइट्स की प्रगतिशील सक्रियता का सुझाव देता है। अत्यधिक देखभाल के साथ राइनल कॉर्टेक्स-हिप्पोकैम्पस स्लाइस तैयार करें। हिप्पोकैम्पस के ऊपर अतिरिक्त ऊतक को हटाने के लिए सुनिश्चित करें क्योंकि यह टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान टुकड़ा अखंडता समझौता कर सकते हैं ।
संरचनात्मक घाटा स्लाइस व्यवहार्यता पर नकारात्मक प्रभाव डालेगा । प्रदर्शित दृष्टिकोणों के अलावा, मिर्गी के बारे में विशिष्ट प्रश्नों को संबोधित करने के लिए पश्चिमी दाग विश्लेषण, रीयल-टाइम पीसीआर और एलिसा जैसे ढेरों परखें इस प्रणाली में लागू की जा सकती हैं ।
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