En modell av epileptogenese i Rhinal Cortex-Hippocampus organotypiske skiver kulturer

Epilepsi er en utbredt nevrologisk sykdom. Rhinal cortex-hippocampus organotypiske skiver skildrer utviklende epileptiske hendelser som ligner in vivo epilepsi og kan derfor brukes som en ex vivo modell av epileptogenese. Dette systemet er faktisk et utmerket verktøy for å overvåke dynamikken og progresjonen av epileptogenese, samt for screening av potensielle terapeutiske mål for denne hjernepatologien.

Å demonstrere prosedyrene med meg vil være mine studenter Francisco Meda og Mafalda Carvalho. For å høste hjernen fra en barseldag seks til syv Sprague-Dawley valp, vask først hodet tre ganger i fem milliliter GBSS. Arbeid i et biosikkerhetsskap, sett skarpe tang fast inn i øyekontaktene for å holde hodet på plass og bruk tynn spisssaks for å kutte hodebunnen langs midtlinjen fra vertebrale foramen til frontal lobes.

Klipp skallen på samme måte og langs cerebral tverrgående sprekker og bruk buede lange tang for å flytte skallestykkene fra hverandre. Bruk en slikkepott til å kaste de olfaktoriske pærene og overføre hjernedråkken opp i en 60 millimeter plate som inneholder fem milliliter kald GBSS. Sett fine tang inn i cerebellum og sett inn slikkepotten langs midtlinjen for å åpne halvkulen forsiktig.

Bruk korte buede tang for å forsiktig fjerne overflødig vev som dekker hippocampus uten å berøre hippocampal strukturen, deretter kutte under hver hippocampus. Overfør en halvkule om gangen hippocampus side opp og parallelt med hverandre på et stykke filterpapir. Legg filterpapiret på et vevshelikopter med halvkule vinkelrett på bladet og kutt halvkulene i 350 mikronskiver.

Overfør det skiver vevet til en ny Petri-tallerken som inneholder fem milliliter kald GBSS og bruk rundspisselektroder for å forsiktig skille skivene og holde bare prøvene med en strukturelt intakt rhinal cortex og hippocampus. DG- og CA-områdene bør være perfekt definert, så vel som entorhinale og perirhinale cortex-regioner. Bruk en slikkepott og en rund spisselektrode til å plassere opptil fire intakte skiver på individuelle innsatser i riktig antall brønner på en seksbrønnsplate som inneholder 1,1 milliliter kulturmedium per brønn.

Bruk en P20 pipette for å fjerne overflødig disseksjonsmedium fra rundt hver skive. Plasser platen i cellekulturinkubatoren. Endre mediet annenhver til tre dager.

Bruk tang til å løfte innsatsen. Aspirer mediet fra tilsvarende brønn og plasser innsatsen tilbake på plass. Bruk en P1000 pipette for å legge til en milliliter frisk 37 grader Celsius medium til hver brønn.

Forbered elektrofysiologioppsettet i en lukket krets. Kontroller at strømningshastigheten til grensesnitttypekammeret er satt til to milliliter per minutt og åpne karbohydratventilen. Kontroller vannstanden i systemet og legg et stykke filterpapir i grensesnittopptakskammeret for å tømme overflødig medium.

Plasser et stykke linserengjøringspapir under rammen for å levere medium til skiven og slå på temperaturregulatoren, forsterkere og mikromanipulatorer. Bruk en sprøyte til å laste en glasselektrode med nylaget kunstig cerebrospinalvæske. Plasser glasselektroden i mottakselektroden og vent til temperaturen i grensesnittkammeret stabiliserer seg ved 37 grader Celsius.

Arbeid i et biosikkerhetsskap, plasser innsatsen i en 60 millimeter plate med en dråpe medium. Bruk et skarpt blad til å kutte en skive fra innsatsen og plasser stykket i grensesnittkammeret med hippocampus nederst til høyre, plasser deretter mottakselektroden i CA3 pyramidecellelaget, start den kontinuerlige oppkjøpsprotokollen og registrer stykket i 30 minutter. For å utføre propidiumjoddopptaksanalysen, arbeid i et biosikkerhetsskap.

Løft innsatsen fra brønnen og tilsett propidiumjodid i medium til en endelig konsentrasjon på to mikromolar per brønn. Rør platen langsomt før du setter innsatsen tilbake i brønnen, og pass på at det ikke er bobler under skivene. Når alle skiver er behandlet, returner platen til cellekulturinkubatoren.

For immunostaining av skivene, på slutten av propidiumjoddinkubasjonen, aspirerer mediet fra bunnen av hver brønn og legger til en milliliter 4% paraformaldehyd til toppen og bunnen av hver innsats. Etter en time ved romtemperatur, vask skivene to ganger i 10 minutter og en milliliter PBS per vask og bruk en hydrofob penn til å tegne to rektangler på mikroskopsklier. Bruk et skarpt blad til å kutte skivene fra innsatsene og plassere ett stykke i hvert rektangel.

Tilsett permeabiliseringsblokkeringsløsning på hver skive for en tre timers inkubasjon ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen legger du til de primære antistoffene av interesse for hver skive for en fire grader Celsius inkubasjon over natten. Neste morgen vasker du skivene med PBS-Tween tre ganger i 10 minutter per vask og inkuberer skivene med de riktige sekundære antistoffene i fire timer ved romtemperatur.

Deretter vasker du skivene som demonstrert og tilsetter 50 mikroliter Hoechst-oppløsning til hver skive for en 20-minutters inkubasjon ved romtemperatur. Etter Hoechst inkubasjon, vask skivene igjen og tilsett 50 mikroliter monteringsmedium til hver enkelt, legg deretter en deksle over skiver og forsegle med neglelakk. Etter å ha latt lysbildene tørke i 24 timer ved romtemperatur, visualiser immunostaining og propidiumjoddopptak ved konfikal mikroskopi.

Rhinal cortex-hippocampus organotypiske skiver skildrer blandet interictal og ictal-lignende aktivitet på syv dager in vitro. Ved 14 dager in vitro er spontan aktivitet preget av iktal utslipp, som utvikler seg til en overveldende iktal aktivitet ved 21 dager in vitro med iktal hendelser som varer mer enn ett minutt. Propidiumjodidopptak og immunhiistokjemi mot nevronmarkøren NeuN avslørte noe nevronal død på syv dager in vitro skiver som er betydelig økt ved 14 dager in vitro i alle områder av hippocampus.

På syv dager in vitro er ramifisert mikroglia med et lavt CD68-uttrykk mer rikelig enn Iba1 positiv CD68 positiv reaktiv mikroglia. Mens ved 14 dager in vitro, i alle områder av hippocampus, Iba1 positiv CD68 positiv amoeboid M1 mikroglia overstiger mikroglia med en lav CD68 uttrykk. Ved 14 dagers in vitro kan noen Iba1-positive CD68-positive celler med et hyper-konsekvensersutseende fastslås, noe som tyder på muligheten for en M2 antiinflammatorisk mikroglia fenotype.

På syv dager in vitro, uttrykket av CD3 er knapt påviselig, mens i 14 dagers in vitro skiver, hypertrofisk glial fibrillary surt protein positiv CD3 positive astrocytter kan observeres, noe som tyder på en progressiv aktivering av A1 astrocytter. Forbered rhinal cortex-hippocampus skiver med ekstrem forsiktighet. Sørg for å fjerne overflødig vev over hippocampus som det kan kompromittere skive integritet under kutting.

Strukturelt underskudd vil ha negativ innvirkning på skivens levedyktighet. I tillegg til de demonstrerte tilnærmingene, kan en mengde analyser som vestlig blotanalyse, sanntids PCR og ELISA brukes på dette systemet for å ta opp spesifikke spørsmål om epileptogenese.