En modell av epileptogenes i rhinal cortex-hippocampus organotypiska slice kulturer

Epilepsi är en utbredd neurologisk sjukdom. Rhinal cortex-hippocampus organotypiska skivor skildrar framväxande epileptiska händelser som liknar in vivo epilepsi och kan därför användas som en ex vivo modell av epileptogenes. Detta system är verkligen ett utmärkt verktyg för att övervaka dynamiken och progressionen av epileptogenes, liksom för screening av potentiella terapeutiska mål för denna hjärnpatologi.

Mina elever Francisco Meda och Mafalda Carvalho demonstrerar procedurerna med mig. För att skörda hjärnan från en postnatal dag sex till sju Sprague-Dawley valp, tvätta först huvudet tre gånger i fem milliliter GBSS. Arbeta i ett biosäkerhetsskåp, sätt fast vassa tång i ögonhålorna för att hålla huvudet på plats och använd tunn spetssax för att skära hårbotten längs mittlinjen från kotgaffeln till frontalloberna.

Skär skallen på samma sätt och längs den cerebrala tvärgående sprickan och använd böjda långa tångar för att flytta skallbitarna isär. Använd en spatel för att kassera luktlökarna och för att överföra hjärndrorna upp till en 60 millimeters platta som innehåller fem milliliter kall GBSS. Sätt in fina tångar i lillhjärnan och sätt in spateln längs mittlinjen för att försiktigt öppna halvklotet.

Använd korta böjda tångar för att försiktigt ta bort överskottsvävnaden som täcker hippocampus utan att röra hippocampalstrukturen och skär sedan under varje hippocampus. Överför en halvklot i taget hippocampus sida upp och parallellt med varandra på ett filterpapper. Placera filterpapperet på en vävnadshackare med halvkloten vinkelrätt mot bladet och skär halvkloten i 350 mikronskivor.

Överför den skivade vävnaden till en ny Petri-skål som innehåller fem milliliter kall GBSS och använd runda spetselektroder för att noggrant separera skivorna och hålla endast proverna med en strukturellt intakt rhinal cortex och hippocampus. DG- och CA-områdena bör definieras perfekt samt de entorhinala och perirhinala cortexregionerna. Använd en spatel och en rund spetselektrod för att placera upp till fyra intakta skivor på enskilda skär i lämpligt antal brunnar på en sexbrunnsplatta som innehåller 1,1 milliliter odlingsmedium per brunn.

Använd en P20-pipett för att ta bort överflödigt dissekeringsmedium runt varje segment. Placera plattan i cellkulturinkubatorn. Byt medium varannan till var tredje dag.

Använd tång för att lyfta insatsen. Aspirera mediet från motsvarande brunn och placera insatsen på plats igen. Använd en P1000 pipett för att lägga till en milliliter färskt 37 grader Celsius medium till varje brunn.

Förbered elektrofysiologin i en sluten krets. Kontrollera att flödeshastigheten på gränssnittstypkammaren är inställd på två milliliter per minut och öppna kolhydratoxventilen. Kontrollera vattennivån i systemet och placera ett filterpapper i gränssnittsinspelningskammaren för att tömma överflödigt medium.

Placera ett linsrengöringspapper under ramen för att leverera medium till skivan och slå på temperaturregulatorn, förstärkarna och mikromanipulatörerna. Använd en spruta för att ladda en glaselektrod med nyberedd konstgjord cerebrospinalvätska. Placera glaselektroden i den mottagande elektroden och vänta tills temperaturen i gränssnittskammaren stabiliseras vid 37 grader Celsius.

Arbeta i ett biosäkerhetsskåp, placera insatsen i en 60 millimeters platta med en droppe medium. Använd ett vasst blad för att skära ett segment från insatsen och placera segmentet i gränssnittskammaren med hippocampus längst ner till höger, placera sedan den mottagande elektroden i CA3-pyramidcellslagret, initiera det kontinuerliga förvärvsprotokollet och spela in segmentet i 30 minuter. För att utföra propidium iodide upptagsanalys, arbeta i ett biosäkerhetsskåp.

Lyft insatsen från brunnen och tillsätt propidiumidodid i medium till en slutlig koncentration av två mikromolar per brunn. Rör långsamt om plattan innan du placerar tillbaka insatsen i brunnen och se till att det inte finns några bubblor under skivorna. När alla skivor har behandlats, sätt tillbaka plattan till cellkulturinkubatorn.

För immunostainning av skivorna, i slutet av propidiumididinkubationen, aspirera mediet från botten av varje brunn och tillsätt en milliliter 4%paraformaldehyd till toppen och botten av varje skär. Efter en timme vid rumstemperatur, tvätta skivorna två gånger i 10 minuter och en milliliter PBS per tvätt och använd en hydrofobisk penna för att rita två rektanglar på mikroskopbilder. Använd ett vasst blad för att skära skivorna från skären och placera ett segment i varje rektangel.

Tillsätt permeabiliseringsblockeringslösning på varje skiva för en tre timmars inkubation vid rumstemperatur. I slutet av inkubationen, tillsätt de primära antikropparna av intresse till varje skiva för en fyra grader Celsius inkubation över natten. Nästa morgon tvätta skivorna med PBS-Tween tre gånger i 10 minuter per tvätt och inkubera skivorna med lämpliga sekundära antikroppar i fyra timmar vid rumstemperatur.

Tvätta sedan skivorna på det sätt som demonstreras och tillsätt 50 mikroliter Hoechst-lösning till varje skiva för en 20-minuters inkubation vid rumstemperatur. Efter Hoechst inkubation, tvätta skivorna igen och tillsätt 50 mikroliter monteringsmedium till var och en, placera sedan ett täckglas över skivorna och försegla med nagellack. Efter att ha tillåtit bilderna att torka i 24 timmar vid rumstemperatur, visualisera immunostaining och propidiumjodidupptag genom confocal mikroskopi.

Rhinal cortex-hippocampus organotypiska skivor visar blandade interictal och ictal-liknande aktivitet vid sju dagar in vitro. Vid 14 dagar in vitro kännetecknas spontan aktivitet av ictal urladdningar, som utvecklas till en överväldigande ictal aktivitet vid 21 dagar in vitro med ictal händelser som varar större än en minut. Propidium iodide upptag och immunohistokemi mot neuronal markör NeuN visade vissa neuronal död i sju dagar in vitro skivor som ökas avsevärt vid 14 dagar in vitro i alla områden av hippocampus.

Vid sju dagar in vitro, ramifierade microglia med en låg CD68 uttryck är mer riklig än Iba1 positiva CD68 positiva reaktiva microglia. Medan vid 14 dagar in vitro, i alla områden av hippocampus, Iba1 positiva CD68 positiva amoeboid M1 microglia överstiger mikroglia med en låg CD68 uttryck. Vid 14 dagar in vitro, vissa Iba1 positiva CD68 positiva celler med en hyper förgrening utseende kan identifieras, vilket tyder på möjligheten till en M2 antiinflammatorisk microglia fenotyp.

Vid sju dagar in vitro är uttrycket av CD3 knappt detekterbara, medan i 14 dagars in vitro skivor, hypertrofa glia fibrillary sura protein positiva CD3 positiva astrocyter kan observeras, vilket tyder på en progressiv aktivering av A1 astrocyter. Förbered rhinal cortex-hippocampus skivor med extrem försiktighet. Se till att ta bort överskottsvävnaden ovanför hippocampus eftersom det kan äventyra skivans integritet under skivning.

Strukturella underskott kommer att påverka segmentens lönsamhet negativt. Förutom de demonstrerade metoderna kan en mängd analyser såsom western blot-analys, PCR i realtid och ELISA tillämpas på detta system för att ta itu med specifika frågor om epileptogenes.