Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Минимизация гипоксии в гиппокампе ломтики от взрослых и старения мышей
Chapters
Summary July 2nd, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Это протокол для острого приготовления ломтик от взрослых и старения мыши гиппокампа, который использует транскардиальной перфузии и ломтик резки с холодной льдий NMDG-ACSF для уменьшения гипоксического повреждения ткани. Полученные ломтики остаются здоровыми в течение многих часов, и подходят для долгосрочного патч-зажима и полевых записей.
Transcript
Представленный здесь протокол уменьшает чрезмерные гипоксические повреждения при подготовке взрослых и стареющих ломтиков гиппокампа мыши, тем самым устраняя серьезное препятствие для изучения функции зрелых и стареющих нейронных цепей. Введение гипотермии в растворы без натрия приводит к гиппокампа ломтики, которые являются здоровыми на срок до 10 часов после резки и подходит как для долгосрочных полевых записей и патч-зажим исследований. Этот метод подготовки ломтиков гиппокампа может быть особенно актуален для животных моделей при нейродегенеративных заболеваниях, которые по определению требуют старения мозга подготовки.
Наиболее важным шагом в этом протоколе является введение гипотермии через транскардиальное изобилие с ледяным раствором. С некоторой практикой, исследователи смогут надежно выполнить этот шаг. Начните с подготовки одного литра решения aCSF для восстановительной камеры и последующих записей.
Затем приготовьте 300 миллилитров NMDG-aCSF для транскардиального изобилия и резки шагов. Поместите вибрирующий микротомный режущей лоток и монтажный диск в морозильную камеру минус 20 градусов по Цельсию. Чтобы подготовить камеру восстановления, заполнить его чуть выше ломтик проведения сетки и начать пузырек поддержанию камеры на скамейке при комнатной температуре.
Охладите все 300 миллилитров NMDG-aCSF в морозильной камере, пока кристаллы льда не начнут образовываться на поверхности и стенах бутылки. Поместите бутылку с охлажденным и NMDG-aCSF на лед и пузырь его, сохраняя раствор между нулем и двумя градусами по Цельсию. Возьмите ткань монтажный диск из морозильной камеры и протрите его сухим, если это необходимо.
Вырежьте блок 5%agar размером с мозг мыши и клей его в центре диска с помощью тонкого слоя клея цианоакрилата. Поместите диск с клееным агаром на лед и накройте его бумажными полотенцами до готовности к использованию. Возьмите режущие лоток из морозильной камеры, поместите его в микротом, а затем окружить его льдом и загрузить лезвие.
Подготовь все инструменты заранее для вскрытия мозга. Настройка перистальтического насоса для перфузии транскардиала. Вставьте одну сторону трубки насоса в бутылку со льдом NMDG-aCSF и подходят с другой стороны с 27 калибровочной иглой.
Установите скорость насоса примерно до 3,5 миллилитров в минуту. При такой скорости отток NMDG-aCSF является быстрым путешествием, а не непрерывным потоком. Поместите мышь на спину на подгузник.
Прежде чем продолжить, подтвердил, что мышь находится на хирургической плоскости анестезии, выполняя щепотку ноша. Мышь должна быть безответной, а затем лентой вниз его передние и задние ноги, так что грудь и живот подвергаются. Вырежьте большой участок кожи на груди, переходя из-под грудины в горло.
Захватите грудину миппами, поднимите ее осторожно и начните прорезать грудную клетку с обеих сторон до тех пор, пока грудная полость не будет выставлена. Вырезать через диафрагму, оставляя лоскут грудной клетки прилагается через тонкий кусок мышцы. Следует иметь возможность отложить его в сторону, не имея его упасть обратно на открытые грудной полости.
Убедитесь, что сердце все еще бьется и убедитесь, что большая часть печени видна. Вставьте иглу в левый желудочек, который выглядит светлее по цвету, чем правый. Чтобы стабилизировать иглу, прогнать его через оставшиеся ребра на левой стороне тела.
Найдите темно-красный правый атриум и прорежьте его маленькими ножницами. Кровь должна начать вытекать. Запустите насос и наблюдайте за печенью, которая изменит цвет с красного на коричневый.
Мониторинг цвета печени и продолжать перфузии, пока печень становится бледно-коричневый. Запустите насос еще на несколько минут. Температура тела животного должна упасть до 28-29 градусов по Цельсию, а нос должен быть холодным на ощупь.
Обезглавить мышь с большими ножницами обезглавливание, а затем использовать скальпель с номером 10 лезвие, чтобы разрезать кожу на верхней части черепа. С небольшими ножницами под углом, вырезать череп в средней линии. Далее, используйте миппы номер три, чтобы вырвать правую и левую половинки черепа, будьте осторожны, чтобы забрать дуру с собой.
Удалите мозг, который должен быть небелого цвета, черпая его с помощью шпателя и падение его в NMDG-ACSF решение на льду. Оставьте его там на минуту. Вывихи мозг из NMDG-aCSF и поместите его на лист фильтровальной бумаги.
Вырезать и удалить 60 градусов клин ткани с 60 градусов инструмент по центру в средней линии от рострального конца forebrain. Используйте разрезанные стороны монтажной поверхности, поскольку она обеспечивает надлежащий угол для ломтиков гиппокампа. Разделите полушария вниз по средней линии скальпелем и приклейте их к монтажу диска.
Возьмите монтажный диск со льда и протрите его сухим, если это необходимо. Затем приклейте каждое полушарие перед агар-блоком, срежьте сторону вниз. Убедитесь, что брюшной стороны обоих полушарий касаются агар-блока и что спинные стороны обоих полушарий обращены к лезвию.
При склеив на разрезе стороны, каждое полушарие должно быть ориентировано по отношению к лезвию таким образом, что обеспечивает поперечные ломтики спинного гиппокампа на месте. Погрузите диск с полушариями в режущую камеру, содержащую ледяной карбогенный NMDG-aCSF. Вырезать 400 микрометровый раздел, а затем использовать одноразовые передачи пипетки с наконечником отсечения для передачи ломтик в камеру восстановления, содержащую карбогенированные NMDG-aCSF при комнатной температуре.
Продолжить резки остальных разделов и передачи их в камеру восстановления занимает не более 10 минут, чтобы сократить в общей сложности от восьми до 10 ломтиков из спинного гиппокампа области. Инкубировать ломтики при комнатной температуре в течение примерно двух часов до записи. Этот протокол был использован для создания ломтиков гиппокампа от взрослых мышей.
Большое количество пирамидальных клеток в поле CA1 и субикулум появляются в низком контрасте, отличительной чертой здоровых клеток, когда наблюдается под инфракрасным дифференциалом контрастной микроскопии. Записи патч-зажима можно получить из нейронов CA1 мышей, которые старше шести месяцев. В примере эксперимента здесь, частота миниатюрных возбуждательных постсинаптических течений была измерена после NMDA-LTD был вызван по отношению к условиям контроля.
Частота миниатюрных возбудительных постсинаптических течений была ниже в нейронах после индукции NMDA-LTD, что указывает на зависимость активности синопсисов в CA1. Изменений амплитуды обнаружено не было. Во время записей mEPSC, клетки CA1 были также заполнены биоцитиным и нетронутыми дендритной беседкой и здоровой клеточной привычкой пирамидальных нейронов можно увидеть здесь.
Надежное распределение флуоресцентного красителя по всей клетке позволяет проводить анализ дендритов и дендритных шипов в различных условиях. Долгосрочная потенция, или LTP, синапсов CA3-CA1 примерно 170%, была отмечена, предполагая, что поддержание сигнальных каскадов, необходимых для LTP присутствует в ломтиках, подготовленных из взрослых мышей. Надежный полевой возбуждающей постсинаптический потенциальный сигнал говорит о том, что сетевая связь также сохранилась.
Двумя важнейшими аспектами протокола являются транскардиальное изобилие с ледяным раствором для индуцирования гипотермии и введение NMDG в качестве заменителя ионов натрия в растворах для предотвращения цитотоксического отека. Используя эти меры предосторожности, острые ломтики могут быть подготовлены из любой области мозга. Кроме того, ломтики, приготовленные таким образом, могут быть использованы для визуализации кальция и напряжения с помощью двух-фотонной или широкой микроскопии.
Этот протокол может послужить основой для стандартизированной подготовки к острым ломтикам гиппокампа от стареющих животных и тем самым облегчить сравнение между исследованиями в контексте механизмов нейродегенеративных заболеваний.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
