You have full access to this content through Seoul National University of Education
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Få humanmikroglia fra voksent menneskelig hjernevev
Summary August 30th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne protokollen er en effektiv, kostnadseffektiv og robust metode for å isolere primærmikroglia fra levende, voksent, menneskelig hjernevev. Isolert primær human mikroglia kan tjene som et verktøy for å studere cellulære prosesser i homeostase og sykdom.
Transcript
Det overordnede målet med protokollen er å isolere primære mikrogliaceller fra levende voksne menneskelige hjernevev. I vårt tilfelle ble dette samlet inn som kirurgisk vindu under operasjonen. Dette oppnås ved først å samle hjernevevet i iskald PBS, vevet blir deretter terninger i 1 mm kube små biter, og jeg gjorde bare ved hjelp av trypsin EDTA.
Etter dette høstes cellene ved sentrifugering og belagt i en kolbe egnet for androgencellekultur i 48 timer. Celler høstes igjen fra kolben og dyrkes til videre bruk. Primære humane mikrogliaceller kan nå karakteriseres ved hjelp av immunocytokjemi og brukes til videre eksperiment.
Den største fordelen med vår protokoll for å isolere mikrogliaceller fra voksne menneskelige hjernevev er at det effektivt gir primære voksne menneskelige mikrogliaceller på en svært kostnadseffektiv måte. Protokollen er robust og reduserer tapet av celler ved å redusere antall trinn som brukes i eksisterende protokoller. Samle vevet i en 50 ml Falcon rør som inneholder 10 ml iskald aCSF.
Tørk oppsamlingsrøret forsiktig med 70% alkohol og overfør til et aseptisk laminær luftstrømningskammer. Kast aCSF nøye og vei vev i Falcon-røret. Beregn den ca vekten av vev ved å utlede vekten av tomt Falcon-rør.
Varm fersk aCSF til 37 grader celsius. Hold vevet i varm aCSF i fem minutter. Dette trinnet er avgjørende for å unngå celledød.
Kast aCSF nøye. Og vaske vev en gang med 1X PBS varmet til 37 grader celsius. Sørg for at alt blod vaskes bort med gjentatte PBS-vasker etter behov.
Inkuber vevet i varmt PBS i 5 minutter. Kast halvparten av PBS nøye. Overfør vev sammen med gjenværende PBS til en sterilisert petriskål.
Fjern gjenværende PBS forsiktig med 1 ml pipette. Dette vil forhindre tap av vev. Terninger som utsteder i minst 1 mm kube små stykker ved hjelp av en steril skalpell.
Tilsett 2 ml 0,25 % trypsin EDTA i petriskålen og vask platen grundig ved hjelp av pipette. Overfør terninger vev til en 50 ml Falcon rør som inneholder 10 ml per gram vev på 0,25% trypsin EDTA. Bland ved å pipetter gjennom en 10 ml serologisk pipette.
Inkuber røret på en shaker i 30 minutter ved 37 grader celsius og hastigheten på 250 rpm. Tilsett 10 ml nøytraliserende medium for å nøytralisere trypsin. Bland godt med en 10 ml serologisk pipette.
Sentrifuger røret ved 2000G ved 4 grader celsius i 10 minutter. Kast den overnaturlige og resuspend pellet i 1 ml kultur medium. Legg cellene i en T25 kolbe egnet for androgen celler og legge til 4 ml ekstra kultur medium.
Kulturmedium vil inneholde 20% L929 supernatant og 1% streptomycin. Det anbefales å legge til L929 supernatant separat i flasker i stedet for å legge til lagerkulturmediet. Vi er ferdige med kolben for å homogent kaste vevet.
Unngå å bringe media til halsen på kolben mens du rister, da dette kan øke sjansene for forurensning. Inkuber kolben ved 37 grader celsius med 5% CO2 i 48 timer. Samle media fra T25 kultur kolbe utarbeidet på dag 0 i sentrifuge rør.
Sentrifuge de innsamlede mediene på 1, 466G ved 4 grader sentrifugering i 4 minutter. Mens det innsamlede mediet sentrifugeres, vasker du dagen 0 kolbe en gang med 1X PBS. Rist kolben forsiktig for å fjerne eventuelle restvevfragmenter igjen.
Unngå hard risting av kolben som noen restfragmenter vil ikke påvirke kulturen negativt. Legg til 5 ml friske kulturmedier i kolben. Kast supernatanten fra sentrifugerte rør.
Tilsett 1 ml kulturmedium til et av rørene og bland godt med pipette. Føljetong legge blandet media med celler til andre rør og bland grundig. Legg cellene i en egen T25 kolbe egnet for androgenceller.
Legg til 4 ml friske kulturmedier i kolben. Inkuber begge kolben ved 37 grader celsius med 5% CO2 i 48 timer. Kast mediene fra begge kolben og legg til friske 5 ml kulturmedier.
Inkuber kolben ved 37 grader celsius ved 5% CO2 i 48 timer. På sjette dag vil cellene være klare for ytterligere eksperimenter. På bildene som er representert her.
Første panel av seksjonen A astrocytter farget med GFAP, grønn i fargen. I det andre panelet, av seksjon En microglia flekk med RCA, grønn i fargen. I avsnittet B microglia farget med RCA, som er grønn i fargen, og astrocytter er farget med GFAP, rød i fargen.
Overlegg av bildene viser microglia og astrocytter sammen. Det er klart fra bildene at flertallet av cellene i kulturen forberedt er microglia. Bildene ble kvantifisert av blindet kontroll og resultatet er representert i seksjon C.Resultatene viste at ca 80% av cellene i kulturen forberedt er microglia celler.
Denne teknikken kan utføres om omtrent en og en halv time. Etter denne prosedyren bør ha en god forståelse av hvordan velger jeg priming microglia fra voksne menneskelige hjernevev, som kan brukes videre for nedstrøms eksperimenter.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
