Login processing...

JoVE Journal
Immunology and Infection

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Immunology and Infection

Analyse af Human Natural Killer Cell Metabolisme

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Journal (Immunology and Infection)

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in Apc^Min/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Renal Subcapsular Transplantation of 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice

Journal (Immunology and Infection)

Renal Subcapsular Transplantation of 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice

Click here for the English version

Analyse af Human Natural Killer Cell Metabolisme

Article DOI: 10.3791/61466-v

June 22nd, 2020 •

Javier Traba^1,2, Thomas A. Waldmann³, Olga M. Anton³

¹Cardiovascular Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, ²Departamento de Biología Molecular, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Autónoma de Madrid (CSIC-UAM), ³Lymphoid Malignancies Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

June 22nd, 2020

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

I dette papir beskriver vi en metode til at måle glykolyse og mitokondriel respiration i primære humane Natural Killer (NK) celler isoleret fra perifert blod, i hvile eller efter IL15-induceret aktivering. Den beskrevne protokol kan let udvides til primære humane NK-celler, der aktiveres af andre cytokiner eller opløselige stimuli.

Transcript

Denne metode giver mulighed for bestemmelse af naturlige killer celle metabolisme. En vigtig parameter i aktiveringen ved at måle iltforbrug og pH-ændringer i det ekstracellulære medium. Fordelen ved den ekstracellulære flux analysator er, at det er fuldt automatiseret og i stand til at teste op til 92 prøver i realtid med lave mængder af celler.

Således giver høj gennemløb skærme. En gyldig metode til at bestemme glykolyse og respiration i inky celler er meget vigtig i klinikken. Da der er mange sygdomme, herunder fedme og kræft, hvor inky celle metabolisme er nedsat.

Begynd med pipettering 20 milliliter lymfocyt separation medium i en 50 milliliter konisk rør. Mens røret i 30 graders vinkel, forsigtigt pipette 20 milliliter blod over mediet. Oprettelse af en synlig og veldefineret grænseflade mellem de to væsker.

Centrifuge rørene i 25 minutter ved 1000 gange G.Derefter forsigtigt tage rørene ud af centrifugen og læg dem i et stativ. Kontroller for tilstedeværelsen af et iøjnefaldende lag af celler på grænsefladen mellem LSM og plasma. Inspirer forsigtigt det mononukleare cellelag med en 10 milliliter plastpipette og læg det i et nyt konisk rør på 50 milliliter.

De mononukleare celler vaskes to gange med 45 milliliter PBS. Og centrifuge dem på 800 gange G i fem minutter. For at isolere de naturlige dræberceller eller tilgaver skal du tælle PVM-havene og opslæmme dem i NK-separationsbuffer på et gange 10 til ottende celler pr. milliliter.

Overfør derefter 10 milliliter af cellesuspensionen til et nyt 50 milliliterrør. Tilføj 500 mikroliter af NK celle isolation antistof mix. Og 10 mikroliter af anti-CD tre positive isolation antistof mix til PBCS.

Og inkuber dem ved stuetemperatur i 10 minutter. Vortex magnetiske perler og tilføje en milliliter til PBCS og antistoffer. Derefter inkuberes MIGS i 10 minutter ved stuetemperatur under lejlighedsvis omrøring.

Tilsæt 35 milliliter NK isolationsbuffer og placer røret på magneten i 15 minutter. Opsam forsigtigt supernatanten med en 50 milliliter plastpipette uden at røre siderne eller bunden af røret. Tæl cellerne og centrifuge dem ved 800 gange G i fem minutter.

For at stimulere NK-cellerne med opløselig midtergang 15 skal der resuspendere 750.000 celler i 100 mikroliter IMDM, der indeholder 10% HS i en brønd på en 96 brøndplade. Fortyndet menneskelig gang 15 til et mikrogram pr. milliliter i IMDM og 10% HS. Og tilsæt 100 mikroliter af den fortyndede menneskelige gang 15 til cellerne.

Reparer en kontrolprøve med ustimulerede celler, og anbring begge prøver i inkubatoren ved 37 grader Celsius. Stimulere cellerne i 48 timer derefter udføre den ekstracellulære flux assay. Dagen før eksperimentet, tænde analysator og lad det varme op til 37 grader Celsius.

Åbn pakken med censorpatronen, og adsk dem patronen fra brugspladen. Derefter tilsættes 200 mikroliter af kalibrantopløsningen til hver brønd på brugspladen. Og sæt den centrale patron tilbage i at sikre, at sensorerne er helt nedsænket.

For optimale resultater inkubere patronen natten over ved 37 grader Celsius i en kuldioxidfri inkubator. Hvilket er ordentligt befugtet. For at forberede en klæbende belagt klinge, pipette 25 mikroliter af cellen klæbemiddel opløsning til hver brønd af pladen.

Og inkuberet ved stuetemperatur i 20 minutter. Fjern derefter opløsningen og vask pladen to gange med 200 mikroliter sterilt vand pr. brønd. Hold pladen åben i 15 minutter inde i cellekulturhætten, så brøndene tørrer.

Centrifuge de tidligere isolerede NK celler tilføje 200 gange G i fem minutter. Fjern derefter supernatanter og vask cellerne i opvarmet mitokondriel stresstest medium eller glykolyse stresstest medium. Pellet cellerne igen og resuspend dem til den foretrukne cellekoncentration i samme medium.

Læg 180 mikroliter af celle suspension pr godt ind i analysen plade. Brug brønde A en, A 12 H en og H 12 som kontrol brønde til baggrundskorrektion. Tilsætning af 180 mikroliter af analysemediet til disse Brønde inkubere pladen i 30 minutter ved 37 grader Celsius i en kuldioxidfri inkubator.

Centrifuge pladen ved 200 gange G i fem minutter. Derefter observere cellerne under mikroskopet for at kontrollere, at de danner et mano lag i bunden af brønden. Inkuber cellerne i yderligere 25 minutter.

Varme arbejdsløsninger til 37 grader Celsius. Og justere deres pH til 7,4 hvis det er nødvendigt. Læg de tidligere forberedte forbindelser til en mitokondriel stresstest eller til en glykolysestresstest i tavler A, B og C på den hydrerede censorpatron Sæt den indlæste censorpatron tilbage i inkubatoren, mens programmet oprettes.

For at oprette den ekstracellulære flux assay protokol, åbne softwaren og bruge gruppedefinitioner til at definere forbehandling betingelser. Brug fanen Plate-kort til at angive de grupper af brønde, der har lignende forhold, angiver også baggrundskorrektionen og tomme brønde. Angiv derefter programmet under fanen Protokoller.

Start programmet, og placer sensorpatronen og brugspladen på bakken. Efter kalibreringstrinnet udskiftes kalibreringspladen for analysepladen med de tilknyttede celler. Når kørslen er fuldført, skal du hente dataene og analysere dem.

For at vurdere renheden og levedygtigheden af NK-cellerne. Små Alec Watts fra PVM havene og den isolerede NK cellepopulation blev plettet og analyseret af flow cytometri. Renheden af NK cellepopulationen blev etableret ved dobbelt opholder sig mod CD 3 og CD 56 eller NKP 46.

Masser af mitokondrielt iltforbrug sats for den menneskelige NK celler er vist her. Som forventet viste I-cellenumre højere OCR-værdier. Celletal også korreleret lineært med mængden af DNA eller protein i brønden.

På den anden side var højere celletal ikke optimale. Fordi ved tilsætning af DNP, iltkoncentrationen i brønden var helt opbrugt i hver cyklus. Hvilket forhindrede en nøjagtig beregning af OCR.

I humane NK-celler blev 100 mikromolar DNP fundet at være den optimale dosis. En typisk mitokondriel stresstest eksperiment med 750, 000 NK celler per brønd er vist her. I denne test Oligomycin fører til et dramatisk fald i iltforbruget.

Og en stigning i ECAR. Som repræsenterer et skift til glykolyse og et forsøg på at opretholde cellulære ATP-niveauer. Aktivering af NK-cellerne ved gang 15 forårsagede en stigning i både mitokondrielt iltforbrug og ekstracellulær forsuring.

Basal Maximal og ATP forbundet respiration øget, men ikke proton lækage eller ikke mitokondriel respiration. Desuden faldt OCR/ECA-hastigheden indikerer et skift til et glykolytisk metabolisme efter IL 15 stimulation. Når du udfører denne protokol, er det meget vigtigt at opnå en ren og sund cellepopulation for at bestemme det optimale cellenummer og at titrere koncentrationen af uanførbare stoffer.

X

Simple Hit Counter