Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Анализ естественного метаболизма клеток-убийц человека
Chapters
Summary June 22nd, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
В этой статье мы описываем метод измерения гликолиза и митохондриального дыхания в первичных клетках естественного убийцы человека (НК), изолированных от периферической крови, в состоянии покоя или после активации, вызванной IL15. Описанный протокол может быть легко распространен на первичные клетки НК человека, активированные другими цитокинами или растворимыми стимулами.
Transcript
Этот метод позволяет определить естественный метаболизм клеток-убийц. Ключевой параметр активации путем измерения потребления кислорода и изменений рН в внеклеточной среде. Преимущество внеклеточного анализатора потока в том, что он полностью автоматизирован и способен тестировать до 92 образцов в режиме реального времени с небольшим количеством клеток.
Таким образом, позволяя высокой пропускной способности экранов. Действительный метод определения гликолиза и дыхания в сложных клетках очень важен в клинике. Поскольку Есть много заболеваний, включая ожирение и рак, где метаболизм иноверных клеток нарушается.
Начните с пипетки 20 миллилитров лимфоцитов разделения среды в 50 миллилитров конической трубки. Сохраняя трубку под углом 30 градусов, аккуратно пипетка 20 миллилитров крови над средой. Создание видимого и четко определенного интерфейса между двумя жидкостями.
Центрифуга труб в течение 25 минут при 1000 раз G.Then тщательно взять трубки из центрифуги и поместить их в стойку. Проверьте наличие заметного слоя клеток на стыке LSM и плазмы. Аккуратно аспирировать моноядерный слой клетки с 10 миллилитров пластиковой пипетки и поместить его в новую 50 миллилитров конической трубки.
Вымойте моноядерные клетки дважды с 45 миллилитров PBS. И центрифуга их на 800 раз G в течение пяти минут. Чтобы изолировать естественные клетки-убийцы или энгавы, подсчитайте моря PVM и повторно посчитайте их в буфере разделения НК в один раз от 10 до восьмого ячейки на миллилитр.
Затем перенесите 10 миллилитров клеточной подвески в новую 50-миллилитровую трубку. Добавьте 500 микролитров смеси антител НК-клеток. И 10 микролитров анти CD три положительные смеси антител изоляции к PBMCs.
И инкубировать их при комнатной температуре в течение 10 минут. Вихрь магнитных бусин и добавить один миллилитр для ПКМ И антител. Затем инкубировать MIGS в течение 10 минут при комнатной температуре с редким перемешиванием.
Добавьте 35 миллилитров буфера изоляции НК и поместите трубку на магнит на 15 минут. Тщательно соберите супернатант с 50 миллилитров пластиковой пипетки, не касаясь сторон или нижней части трубки. Подсчитайте клетки и центрифуга их на 800 раз G в течение пяти минут.
Для стимуляции НК-клеток с растворимым проходом 15, повторно 750 000 клеток в 100 микролитров IMDM, содержащих 10%HS в колодец 96 пластины. Разбавить человеческий проход от 15 до одного микрограмма на миллилитр в IMDM и 10%HS. И добавить 100 микролитров разбавленного прохода человека 15 к клеткам.
Ремонт контрольного образца с нестимулированных клеток и место обоих образцов в инкубаторе на 37 градусов по Цельсию. Стимулировать клетки в течение 48 часов, а затем выполнить внеклеточный анализ потока. За день до эксперимента включите анализатор и дайте ему прогреться до 37 градусов по Цельсию.
Откройте пакет картриджа цензора и отделить картридж от утилиты пластины. Затем добавьте 200 микролитров раствора калибранта к каждой пластине утилиты. И поместите центральный картридж обратно в убедившись, что датчики полностью погружены.
Для достижения оптимальных результатов инкубировать картридж на ночь при 37 градусах по Цельсию в инкубаторе без двуокиси углерода. Который правильно увлажняется. Для приготовления клея покрытием лезвие, пипетка 25 микролитров клеточного клея раствор для каждого колодец пластины.
И инкубируется при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем снимите раствор и промойте пластину дважды 200 микролитров стерильной воды на колодец. Держите пластину открытой в течение 15 минут внутри капота клеточной культуры, чтобы колодцы высохли.
Центрифуга ранее изолированных нк-клеток добавить 200 раз G в течение пяти минут. Затем удалите супернатанты и промыть клетки в разогретой митохондриальной среде стресс-теста или гликолиза стресс-теста среды. Пеллет клетки снова и повторно их предпочтительной концентрации клеток в той же среде.
Положите 180 микролитров клеточной подвески на колодец в анализную пластину. Используйте скважины A one, A 12 H one и H 12 в качестве контрольных скважин для фоновой коррекции. Добавление 180 микролитров среды анализа к этим скважинам инкубировать пластину в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию в инкубаторе без двуокиси углерода.
Центрифуга пластины при 200 раз G в течение пяти минут. Затем наблюдайте за клетками под микроскопом, чтобы проверить, что они образуют слой мано в нижней части колодец. Инкубировать клетки в течение еще 25 минут.
Теплые рабочие решения до 37 градусов по Цельсию. И скорректировать их рН до 7,4, если это необходимо. Загрузите ранее подготовленные соединения для митохондриального стресс-теста или для стресс-теста гликолиза в доски A, B и C гидратированного картриджа цензора Положите загруженный картридж цензора обратно в инкубатор при настройке программы.
Чтобы настроить протокол анализа внеклеточного потока, откройте программное обеспечение и используйте определения группы для определения условий предварительной обработки. Используйте вкладку карты плиты, чтобы указать группы скважин, которые имеют аналогичные условия, также указывают на фоновую коррекцию и пустые скважины. Затем установите программу во вкладке протоколов.
Запустите программу и поместите сенсорный картридж и утилиту пластины на лоток. После шага калибровки замените калибрантную пластину на анализную пластину на прикрепленные клетки. После завершения времени вы получите данные и проанализируйте их.
Для оценки чистоты и жизнеспособности НК-клеток. Малый Алек Уоттс из морей PVM и изолированной популяции клеток НК были окрашены и проанализированы потоком цитометрии. Чистота популяции ячеек НК была установлена путем двойного пребывания против CD 3 и CD 56 или NKP 46.
Много митохондриальной скорости потребления кислорода для клеток НК человека показаны здесь. Как и ожидалось, номера ячеев I отображаются более высокими значениями OCR. Номера клеток также линейно коррелируют с количеством ДНК или белка в колодец.
С другой стороны более высокие номера клетки не были оптимальны. Потому что после добавления DNP, концентрация кислорода в оке была полностью истощена в каждом цикле. Что помешало точному расчету OCR.
В клетках НК человека, 100 микромоляных DNP было установлено, что оптимальная доза. Здесь показан типичный эксперимент митохондриального стресс-теста с 750 000 НК-клеток на колодец. В этом тесте олигомицин приводит к резкому снижению потребления кислорода.
И увеличение ECAR. Что представляет собой переход на гликолиз и усилия по поддержанию клеточного уровня АТФ. Активация НК-клеток по проходу 15 вызвала увеличение как потребления митохондриального кислорода, так и внеклеточного подкисления.
Базальный Максималь и АТФ связаны дыхание увеличилось, но не протон утечки или не митохондриального дыхания. Кроме того, скорость OCR/ECA снизилась, что свидетельствует о переходе к гликолитическому метаболизму после стимуляции IL 15. При выполнении этого протокола очень важно получить чистую и здоровую популяцию клеток, чтобы определить оптимальное количество клеток и определить концентрацию uncablers.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
