Laser-Capture Microdissection RNA-sekvensering för rumsliga och temporala vävnadsspecifika genuttryck analys i växter

Detta protokoll använder Laser-Capture Microdissection tillsammans med RNA-Sekvensering för att erhålla spatiala och tidsmässiga transkriptomer från specifika celler i anläggningar av intressen, med hjälp av små mängder biologiska material. Den största fördelen med laserteknik är att den underlättar direkt visualisering av celler inom normal vävnadskontext, vilket gör att de diskreta cellerna exakt kan isoleras på ett kontaktfritt sätt. Även om detta protokoll är optimerat för isolering av växtceller, kan det tillämpas på de flesta celler som kan vara stologiskt identifierade.

Bra provpreparering är kritiskt. Därför är en som utför denna teknik för första gången, prop optimering av vävnaden fixering och inbäddningen viktigt innan Laser-Capture Microdissection. Före insamling av vävnadsprovet, bered ett fixativt som är lämpligt för den art och vävnadstyp som skall skördas.

För kornfrö, skär fröproverna i hälften innan du dränker proverna i minst en 10 X-volym iskallt fixativ. Använd vakuuminfiltration för att påskynda penetrationen av fixativet. Vävnaden bör sjunka i slutet av infiltrationen, sedan uppdatera fixative för en övernattning inkubation och överföra proverna till kassetter för vävnad bearbetning.

Placera vävnaden lastade kassetter i metallkorgen på en automatisk processor och fäst metallkorgen på sin hållare ovanför kammare ett. Ställ in programmet på styrpanelerna i vävnadsprocessorn och tryck på start för att påbörja det automatiska bearbetningsprogrammet. Systemet kommer att torka ut proverna genom att doppa kassetterna i en gradient serie etanol i 90 minuter per koncentration enligt angivan.

Efter den sista etanolbadningen kommer systemet att dränka proverna i xylengradienter i 90 minuter per lösning enligt angivelse. Följt av 290 minuters nedsänkning i smält paraffin vid 55 till 60 grader Celsius. Nästa morgon, ta bort paraffin infiltrerade kassetter från vävnad processorn och fortsätt till paraffin inbäddning.

Nästa morgon, använd fina tövädrar för att överföra processen prover till lämpligt storlek formar och tillsätt smält paraffin över varje prov. För kornfrön, orientera proverna i paraffinet longitudinellt till skärriktningen för att underlätta anskaffningen av längsgående sektioner. Placera en ren kassett på formen och se till att hela kassetten är helt täckt med en tillräcklig volym paraffin för att säkra provet på kassetten.

Placera sedan formen på en kall tallrik i 10 till 20 minuter tills paraffin är inställd innan du släpper blocket från formen. För att förbereda en PEN Membran Diabilder, dränka diabilderna i RNS avaktiverande lösning i tre sekunder följt av två korta tvättar och DEPC behandlat vatten. Sedan köra bilderna i en 370 grader Celsius inkubator för att ta bort överblivna lösning och UV behandla diabilder i en laminär flöde skåp i 30 minuter för att förbättra deras paraffin inte hasselnötter.

För ett prov vävnadssektionering placera paraffinblocken på kallplattan och fyll vattenbadet med DEPC-behandlat vatten, värm sedan till 42 grader Celsius. Trimma block till djupet av regionen av intresse och avsnitt paraffin block till en sex till 10 mikron tjocklek. En väl sektionerad block kommer att bilda ett band vid kanten av bladet.

Använd en fin pincett för att försiktigt överföra band från mikrotomen till vattenbadet, var noga med att bandet lägger sig platt på vattenytan. För att samla upp sektionerna, hålla en bild i 45 graders vinkel, använd en uppåtgående rörelse för att lyfta ett band ur vattnet på bilden och använda en ludd fri vävnad för att försiktigt ta bort överflödigt vatten. När alla sektioner har samlats in, tvätta objektglasen med 320 andra tvättar i xylen följt av 230 sekunder tvättar i 100%etanol och 230 andra tvättar i 70%etanol.

Till microdissect celler av intresse från deparraffinerade och torra vävnad sektioner, ladda diabilder på de tre LCM mikroskop slitsar och ladda samlingsröret i de tillgängliga slitsar. Flytta scenen för att lokalisera den region av provet som måste skäras och skär ett tomt segment fritt från vävnad på membranet slide. För att optimera skärhastigheten och skärningen i lasertryckskatapulting energi och fokus.

Använd ritverktygen för att skissera området av intresse i vävnaden och använd de optimerade parametrarna och Robo LPC-funktionen för att katapultcellerna in i de självhäftande locken. Välj flagga från elementlistan om du vill använda flaggverktyget för att markera de områden som är av intresse. Kontrollera knappen för kontroll av lock för att inspektera den självhäftande locket, för att bekräfta att proverna har fångats.

Typiskt 10 till 15 sektioner per lock krävs för RNA-extraktion. Omedelbart efter att alla prover har förvärvats, fortsätt omedelbart till RNA-extraktion för att undvika RNA-nedbrytning. Efter RNA-utvinning och RNA-amplifiering använd ett automatiserat elektroforessystem, enligt tillverkarens instruktioner för att kvantifiera och kvalificera antisense RNA.

I denna studie, LCM, RNA-sekvensering tillämpades på ett litet antal celler från tre embryo organ, var åtta timmar under en 48 timmars tid kurs under grobarhet. Det är viktigt att justera skärparametrarna korrekt så att vävnaden av intresse att skäras och lossna från den omgivande vävnaden utan att bränna kanten av det valda området. Förgreningen av det totala RNA före RNA-amplifiering gör det möjligt att upptäcka distinkta elektroforetiska band och fluorescerande toppar på 18 och 28S ribosomala underenheter i RNA-prover av god kvalitet.

Framgångsrikt syntetiseras antisense RNA kommer att uppvisa en unimodal symmetrisk storlek distribution från 100 till 1000 nukleotider med en topp runt 300 nukleotider efter två omgångar av förstärkning. Flerdimensionell skala plottning av gener uttryckt i de olika vävnaderna över 48 timmar av grobarhet, illustrerar en större likhet mellan prover av en enda vävnad än mellan prover från samma tidpunkt punkt, men olika vävnader. Antalet differentiellt uttryckta gener ökar successivt under loppet av grobarhet i varje vävnad i förhållande till noll timme tidspunkten för vävnaden.

I denna representativa analys, 25%av plumule, 34%av radicle och 41%av scutellum differentially uttryckt gener befanns vara uteslutande uttryckt inom varje vävnad. Det är viktigt att korrekt justera skärparametrarna för en exakt excision och dislodging av väljarområdet från den omgivande vävnaden utan att bränna kanten av den valda regionen. Med förbättrade kromatin och protein rening metoder, och förbättra masspektrometri instrument, LCM kan användas för celltyp specifika epigenomiska och proteomik studier implantat.