במבחנה טריז פרוסה הכנה עבור חיקוי בקישוריות מעגל עצבי Vivo

ניסויים בפרוסות מוח מאפשרים חקירה של תפקוד עצבי ברזולוציה חשמלית ותכופת גבוהה, אך פרוסות אלה בדרך כלל מנתקות קשרים פרה-סינפטיים רבים. פרוסה בצורת טריז שומרת על מעגלים פרה-סינפטיים שלמים יותר. פרוסת מוח מותאמת זו שומרת על מעגל עצבי מלא יותר דמוי vivo תוך מתן היתרונות של ניסויים במבחנה, כגון הקלטות מהדק תיקון מונחה חזותית, פרמקולוגיה והדמיית פעילות.

ניתן להעריך גיאומטריה פרוסה טריז מדויקת בהתבסס על מיקומי האטלס של הנוירונים בתוך המעגל, אך יש לקבוע את שלמות השרטוטים והאקסונים הקדם-סינפטיים באמצעות היסטולוגיה. התחל על ידי שימוש בסכין גילוח כדי לחתוך את העור במרכז הגולגולת מהאף עד החלק האחורי של הצוואר. לקלף בחזרה את העור כדי לחשוף את הגולגולת ולהתחיל בבסיס הגולגולת ולהמשיך לכיוון האף, להשתמש במספריים קטנים כדי להפוך חתך בגולגולת דרך קו האמצע.

בתפר lambda, לעשות חתכים בגולגולת מקו האמצע לצדדים לכיוון האוזן משני הצדדים כדי לקלף בחזרה את הגולגולת כדי לחשוף את המוח. החל בקצה rostral, להשתמש מרית מעבדה קטנה בעדינות להרים את המוח מהגולגולת כדי לאפשר עצבי הראייה להיות מנותק. המשך לעבוד בעדינות את המוח לאחור, חושף את פני השטח הגחוני ולהשתמש מטלפים עדין כדי לצבוט בזהירות את העצבים trigeminal ליד פני השטח הגחוני של גזע המוח כדי לחתוך אותם.

מניחים את ההכנה בצלחת פטרי זכוכית מלאה בתתח חיתוך קר ומ מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ נתוח. חותכים את עצבי הפנים קרוב לגזע המוח כדי לחשוף את העצבים פרוביודולוקוקלאר. השתמש מדחפים עדין לדחוף את הטיפים לתוך foramina שבו העצב vestibulocochlear יוצא הגולגולת ככל האפשר.

צובטים כדי לנתק את העצבים משני הצדדים, משאירים את שורש העצב מחובר לגזע המוח. הסר את קרום המוח ואת כלי הדם מפני השטח הגחוני של גזע המוח ליד הגוף הטרפז. ואז לצבוט את העצבים הגולגולתיים הנותרים ואת רקמת החיבור כדי לשחרר את המוח לחלוטין מן הגולגולת, דואג לשמור על חוט השדרה הנותר, אם אפשר.

כדי להכין את פני השטח של המוח עבור מתקן לשלב למקם את הצד הגחוני במוח למעלה ולהשתמש בכלי קהה בעדינות לשתק את חוט השדרה כדי לייצב את רקמת המוח. הכנס ממטרים פתוחים בזווית של כ -20 מעלות דרך המוח לתחתית המנה, כך שהטיפים יוצאים מפני השטח הגביים של המוח caudal אל chiasm אופטי ולהשתמש סכין גילוח לחתוך לאורך המדפים. לאחר מכן, הכינו גוש סנטימטר מעוקב אחד של 4% אגר והפיצו טיפת דבק קטנה למלבן על הבמה.

השתמש מדפים כדי להרים בזהירות את המוח בעדינות לטבול את הנוזל העודף עם קצה של מגבת נייר. לאחר מכן מניחים את המשטח החסום על הדבק כך שמשטח הגחון יעמוד לכיוון הלהב במהלך החיתוך ודוחים את גוש הגר בעדינות על פני הגב כתמיכה. כדי לרכוש פרוסות טריז עם שורש עצבי השרוך בצד העבה והנוירונים האוליבוקוכלאריים המדיאליים והגרעין המדיאלי של הגוף הטרפז בצד הדק, מניחים את הדיסק המגנטי עם המוח המחובר על מחזיק הבמה וממקמים את המחזיק בתא החותך של רטט עם פני השטח הגחוני של המוח המכוונים לכיוון הלהב.

ממלאים את התא בתסכולת חיתוך קר כקרח ומורידים את הלהב לתופת בועות קרבוגן. חותכים פרוסות caudal לאזור העניין כדי לוודא את הפרוסות הם סימטריים. ואז להעביר את הבמה כ 15 מעלות לצד אחד.

המשך לחתוך בזהירות עד ששורש עצב השמיעה קרוב לפני השטח בצד אחד ועצב הפנים ניתן לראות על פני השטח של הצד השני של הפרוסה. הסט את השלב 15 מעלות בחזרה למיקום המקורי והזז את הלהב הרחק מהרקמה. סובב את בסיס הבמה ב-90 מעלות כך שהקצה הצדדי של הצד הדק פונה אל הלהב ומנמיך את הלהב כמה מאות מיקרון לפני שהוא מקרב באיטיות את הלהב לקצה הרקמה.

עם הלהב נסוג מעט להוריד את הלהב לעובי הרצוי של הקצה הדק של הפרוסה. להזיז את הלהב בחזרה מן הרקמה ולסובב את בסיס הבמה בחזרה, כך משטח הגחון פונה לבסיס הבמה. לעשות חתך כדי לייעד את פני השטח rostral של פרוסת טריז ולהעביר את הפרוסה לפיסת סנטימטר מרובע אחד של משטח צרוב נייר ממשק למטה.

עצב הפנים צריך להיות גלוי על שתי ההמיספרות של הפרוסה על פני השטח rostral. ואז להעביר את הפרוסה לתא הדגירה 35 מעלות צלזיוס להתאושש במשך 30 דקות. כדי להגדיר את פרוסת טריז לניתוח electrophysiology למקם את המדגם לתוך תא הקלטה כי הוא להיות מנוון ברציפות עם 35 מעלות צלזיוס ACSF ולייצב את הפרוסה.

באמצעות אופטיקה DIC, להתמקד שורש עצב השמיעה בצד העבה של הפרוסה ולהשתמש micromanipulator להעביר את האלקטרודה מגרה טונגסטן דו קוטבית לשורש העצב השמיעתי בעדינות לתוך פני השטח של הרקמה. הזז את שדה התצוגה לגרעין הגחוני של גוף הטרפז בצד הדק ובחר נוירון olivocochlear המדיאלי כיעד לאלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי תחת אפיפלואורסצנטיות באמצעות מסנן פליטת ננומטר 561. מלא פיפטה הקלטה עם הפתרון הפנימי המתאים לניסוי המוצע תחת תיקון אופטיקה DIC ולהקליט מן הנוירון olivocochlear המדיאלי בתצורת התא כולו.

התאם את משרעת הגירוי החשמלי של שורש עצב השמיעה כדי להשיג אירועים פוסט-סינפטיים עקביים בנוירון האוליבוקוכלארי המדיאלי. לאחר מכן הפעל פרוטוקולי גירוי מתאימים כדי להתבונן בזרמים סינפטיים מעוררים בנוירונים אוליבוקוכלאריים מדיאליים. הכנת פרוסת טריז זו נועדה להכיל את שורש עצב השמיעה ואת גרעין הברגים בניגוד לנוירונים המדיאליים olivocochlear המיועדים להקלטות.

בפרוסת טריז מוכתמת קרשיל סגולה זו, גרעין המשפך נמצא כמעט במלואו. ושורש עצב השמיעה נצפה נכנס לגרעין התיש. בנוסף, פרוסת טריז מכיל נוירונים של הגרעין המדיאלי של ipsilateral הגוף הטרפז לנוירונים olivocochlear המדיאלי שממנו מבוצעות הקלטות.

כדי לאשר את הקישוריות העצבית בתוך פרוסת טריז תשומות presynaptic מגורים בשתי דרכים. ראשית, סטריה אקוסטית הגחונית בקו האמצע מגורה חשמלית, הפעלת T-stellate אקסונים ישירות ואת הגרעין המדיאלי של נוירוני הגוף הטרפז באמצעות גירוי אקסון תאים סבוך כדורי וכתוצאה מכך זרמים פוסט-סינפטיים הנמדדים בנוירון אוליבוקוכר המדיאלי. שורש עצב השמיעה מגורה לאחר מכן כדי להפעיל את כל מעגלי המוח העולים monaural ולעורר תגובות postsynaptic.

השוואה של מידות ההשהיה של הזרם הפוסט-סינפטי הראשון שעורר עם גירוי ישיר של הסטריה האקוסטית הגחונית עם אלה שעוררו גירוי עצבי שמיעתי חושפת השהיה ארוכה יותר באופן משמעותי באירוע הגירוי העצבי השמיעתי, מה שמעיד על העיכוב הסינפטי הנובע מהסינאפסה הנוסף של גרעין שבכה המופעל במהלך גירוי עצבי שמיעתי. השימוש בציוני דרך אנטומיים ותמרון זהיר של שלב הדיסק המגנטי הם קריטיים ליצירת פרוסות טריז עם מעגלים עצביים שלמים ותגובות סינפטיות אמינות. טכניקת חיתוך זו מספקת פלטפורמה לשימוש בכלים נוספים לאלקטרופיזיולוגיה חוץ-חוץ-תאית, כולל הדמיה של סידן או מתח, אופטוגנטיקה, אי-ניתור נוירוטרנסמיטר, ופרמקולוגיה תאית וחוץ-תאית.