生体内ニューロン回路接続を模倣するためのインビトロウェッジスライスの準備

脳スライス実験は、高い電気的および時間的分解能を有する神経機能の尋問を可能にするが、これらのスライスは通常、多くのシナプス前接続を切断する。くさび状のスライスは、より無傷のシナプス前回路を維持します。この修飾された脳のスライスは、視覚誘導パッチクランプ記録、薬理学、および活動イメージングなどのインビトロ実験の利点を提供しながら、より完全な生体様神経回路を維持します。

正確なウェッジスライス幾何学は、回路内のニューロンのアトラス位置に基づいて推定することができるが、シナプス前のスキーマと軸索の完全性は、構造学を使用して決定されるべきである。まず、カミソリの刃を使用して、頭蓋骨の正中線の皮膚を鼻から首の後ろに切り取ります。頭蓋骨を露出させるために皮膚を剥がし、頭蓋骨の基部から始まり、鼻に向かって続き、小さなはさみを使用して中線を通して頭蓋骨の切開を行います。

ラムダ縫合糸では、正中線から両側の耳に向かって左右に頭蓋骨を切り取り、頭蓋骨を剥がして脳を露出させます。鼻孔の端から始めて、小さなラボのヘラを使用して頭蓋骨から脳を静かに持ち上げ、視神経を切断できるようにします。脳を穏やかに後方に働き続け、腹側表面を露出させ、細かい鉗子を使用して脳幹の腹側表面付近の三叉神経を慎重につまんで切断する。

冷たいスライス溶液で満たされたガラスペトリ皿に準備を入れ、解剖顕微鏡の下に皿を置きます。脳幹に近い顔面神経をトリミングして、前庭神経を露出させます。痕跡神経が頭蓋骨を可能な限り出る前庭に先端を押し込むために細かい鉗子を使用してください。

脳幹に取り付けられた神経根を残して、両側の神経を切断するためにピンチ。台形体近くの脳幹の腹側表面から髄膜と血管系を取り除きます。その後、残りの脳神経と結合組織をつまんで頭蓋骨から脳を完全に解放し、可能であれば残りの脊髄を維持するように注意します。

ステージにフィクスチャのための脳の表面を準備するには、脳腹側を上に置き、脳組織を安定させるために脊髄を穏やかに固定化するための鈍いツールを使用します。脳を通して約20度の角度で開いた鉗子を皿の底に挿入し、先端が脳の背側表面を視チアズムに出て、カミソリの刃を使って鉗子に沿って切断するようにします。次に、4%寒天の1立方センチメートルブロックを準備し、ステージ上の長方形に接着剤の小さな滴を広げます。

鉗子を使用して慎重に脳を持ち上げ、余分な液体をペーパータオルの端でそっと手を出します。次に、ブロックされた表面を接着剤の上に置き、腹側の表面がスライス中にブレードの方向に向くようにし、寒天ブロックを支持体として後側の表面にそっと押し付けます。厚い側の内腔神経根と内側のオリボコクレアニューロンと台形体の内側核を薄い側に置いてくさびのスライスを取得するには、取り付けられた脳を持つ磁気ディスクをステージホルダーに置き、脳の腹側をブレードに向けた振動体のスライシングチャンバーにホルダーを置きます。

チャンバーに氷冷スライス液を充填し、ブレードをカルボゲンバブル溶液に下げます。スライスが対称になるように、目的の領域に切り取ります。その後、ステージを15度程度片側に移動します。

聴覚神経根が片側の表面に近づくまで慎重にスライスを続け、スライスの反対側の表面に顔面神経が見える。ステージを元の位置に15度戻し、ブレードを組織から遠ざけます。ステージベースを90度回転させて、薄い側の側面の端がブレードに向き、ブレードを数百ミクロン下げてから、ゆっくりとブレードを組織の端に近づけます。

ブレードを引き込んだ後、ブレードをスライスの薄いエッジの所望の厚さに下げます。ブレードを組織から戻し、腹側表面がステージベースに向かるようにステージベースを後ろに回転させます。カットしてウェッジスライスのロストラル表面を指定し、スライスを1平方センチメートルのインターフェースペーパーの表面に移します。

顔面神経は、rostral表面上のスライスの両方の半球に表示される必要があります。その後、スライスを35°Cのインキュベーションチャンバーに移動して30分間回復します。エレクトロ生理解析用にウェッジスライスを設定するには、サンプルを35°CのACSFで連続的に浸透している記録チャンバーに入れ、スライスを安定化させます。

DIC視を使用して、スライスの厚い側の聴覚神経根に焦点を当て、マイクロマニピュレータを使用して双極タングステン刺激電極を聴覚神経根に移動させ、組織の表面にそっと移動させます。薄辺の台形体の腹側核に視野を移動し、561ナノメートルの発光フィルターを使用して、発蛍光下のパッチクランプ電気生理学の標的として内側オリボコクレアニューロンを選択します。提案された実験に適した内部溶液を記録ピペットに充填し、DIC光学パッチの下で、全細胞構成の内側オリボコクリアニューロンから記録します。

聴覚神経根の電気刺激振幅を調整して、内側オリボコクリアニューロンで一貫したポストナプティクス事象を得る。次に、適切な刺激プロトコルを実行して、内側オリボコクレアニューロンにおける呼び起こされるシナプス電流を観察する。このウェッジスライス調製物は、録音対象の内側オリボコクレアニューロンに対する聴覚神経根および人工内核を含有するように設計されている。

このクレシルバイオレット染色切除ウェッジスライスでは、人工内核はほぼ完全なロストラル・コーダルの範囲に存在する。そして、聴神経根は人工内核に入って観察される。さらに、ウェッジスライスは、記録が行われる内側オリボコクレアニューロンに対する台形体の内側核のニューロンを含む。

ウェッジスライスシナプス前入力内の神経結合性を確認するには、2つの方法で刺激される。まず、正中線の腹側音響線素は電気的に刺激され、球状ふさふさした細胞軸索刺激を介してT-星状軸索および台形体ニューロンの内側核を直接活性化し、内側オリボコクレアニューロンで測定される心筋波流をもたらす。聴覚神経根は、その後、モノラル上昇脳幹回路全体を活性化し、心筋応答を呼び起こすために刺激される。

腹側神経刺激で誘発される腹腔音響線素の直接刺激で誘発された最初の心内聴き電流の発症遅延測定と聴覚神経刺激で誘発される遅延の比較は、聴覚神経刺激事象における有意に長い遅延を明らかにし、聴覚神経刺激の間に活性化された追加の人工内核シナプスに起因するシナプス遅延を示す。解剖学的ランドマークの使用と磁気ディスクステージの慎重な操縦は、無傷の神経回路と信頼性の高い呼び起こされるポストシナプス応答を持つウェッジスライスを作成するために重要です。このスライス技術は、カルシウムや電圧イメージング、光遺伝学、神経伝達物質の老化、細胞内および細胞外薬理学の両方を含む、追加のインビトロでの電気生理学ツールを使用するためのプラットフォームを提供します。