Journal
/
/
In Vitro Wedge Slice Förberedelse för Härma In Vivo Neuronal Circuit Connectivity
JoVE Journal
Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.
JoVE Journal Neuroscience
In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In Vitro Wedge Slice Förberedelse för Härma In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

5,354 Views

10:31 min

August 18, 2020

DOI:

10:31 min
August 18, 2020

2 Views
,

Transcript

Automatically generated

Hjärnan skiva experiment tillåta förhör av neuronal funktion med hög elektrisk och tidsmässig upplösning, men dessa skivor vanligtvis bryta många presynaptic anslutningar. En kilformad skiva upprätthåller en mer intakt presynaptiska kretsar. Denna modifierade hjärnan skiva upprätthåller en mer komplett in vivo-liknande neuronal krets samtidigt som fördelarna med in vitro-experiment, såsom visuellt guidade patch clamp inspelningar, farmakologi, och aktivitet bildbehandling.

Exakt kil skivad geometri kan uppskattas baserat på atlas platser av nervceller inom kretsen, men integriteten hos presynaptiska schemata och axoner bör bestämmas med hjälp av histologi. Börja med att använda ett rakblad för att skära huden vid mittlinjen av skallen från näsan till baksidan av halsen. Skala tillbaka huden för att exponera skallen och börjar vid basen av skallen och fortsätter mot näsan, använd små saxar för att göra ett snitt i skallen genom mittlinjen.

Vid lambda sutur, gör nedskärningar i skallen från mittlinjen i laterled mot örat på båda sidor för att skala tillbaka skallen för att exponera hjärnan. Börjar vid rostral slutet, använd en liten lab spatel för att försiktigt lyfta hjärnan från skallen så att synnerverna att vara avskurna. Fortsätt att försiktigt arbeta hjärnan bakåt, utsätta den ventrala ytan och använda fina tång för att försiktigt nypa trigeminal nerver nära den ventrala ytan av hjärnstammen att skära dem.

Placera preparatet i en petriskål av glas fylld med kall skivningslösning och placera skålen under ett dissekerande mikroskop. Trimma ansiktsnerverna nära hjärnstammen för att exponera nerverna i Vestibulocochlear. Använd fina tänjningar för att trycka in spetsarna i foramina där den vestibulocochlear nerven lämnar skallen så långt som möjligt.

Nypa för att bryta nerverna på båda sidor, lämnar nervroten fäst vid hjärnstammen. Ta bort hjärnhinnorna och vasculaturen från hjärnstammens ventrala yta nära trapetskroppen. Sedan nypa de återstående kranialnerverna och bindväven för att frigöra hjärnan helt från skallen, var noga med att bevara den återstående ryggmärgen, om möjligt.

För att förbereda ytan av hjärnan för fixtur till scenen placera hjärnan ventrala sidan upp och använda ett trubbigt verktyg för att försiktigt immobilisera ryggmärgen för att stabilisera hjärnvävnaden. Sätt in öppna tång i en cirka 20 graders vinkel genom hjärnan till botten av skålen så att spetsarna lämnar dorsala ytan av hjärnan caudal till optik chiasm och använda ett rakblad för att skära längs tång. Därefter förbereder en en kubikcentimeter block på 4%agar och sprida en liten droppe lim i en rektangel på scenen.

Använd forceps för att försiktigt lyfta hjärnan och försiktigt badda överflödig vätska med kanten av en pappershandduk. Placera sedan den blockerade ytan på limmet så att den ventrala ytan kommer att vara vänd mot bladets riktning under skivning och tryck agarblocket försiktigt mot ryggytan som stöd. Att förvärva kilskivor med cochlear nerv rot på den tjocka sidan och den mediala olivocochlear nervceller och den mediala kärnan i trapetsoid kroppen på den tunna sidan, placera den magnetiska skivan med den bifogade hjärnan på scenen innehavaren och placera innehavaren i skivningskammaren av en vibratom med den ventrala ytan av hjärnan orienterad mot bladet.

Fyll kammaren med iskall skivningslösning och sänk bladet i karbiogenbubbade lösningen. Skär skivor caudal till regionen av intresse för att se till att skivorna är symmetriska. För sedan stadiet cirka 15 grader åt ena sidan.

Fortsätt skära försiktigt tills hörselnerven roten är nära ytan på ena sidan och ansiktsnerven kan ses vid ytan av den andra sidan av skivan. Förskjut scenen 15 grader tillbaka till ursprungsläget och flytta bladet bort från vävnaden. Snurra på scenbasen 90 grader så att den tunna sidans sidokant är vänd mot bladet och sänker bladet flera hundra mikron innan du långsamt för bladet nära vävnadens kant.

Med bladet indraget sänks bladet något till önskad tjocklek av den tunna kanten av skivan. Flytta bladet tillbaka från vävnaden och snurra scenen basen tillbaka så att den ventrala ytan är vänd mot scenen bas. Gör ett snitt för att beteckna den rostrala ytan av kilskivan och överför skiva till en en kvadratcentimeter bit gränssnitt papper caudle yta ner.

Ansiktsnerven ska vara synlig på båda halvkloten av skivan på rostral yta. Flytta sedan skivan till en 35 grader Celsius inkubation kammare för att återhämta sig i 30 minuter. För att ställa in kilskivan för elektrofysiologi analys placera provet i en inspelningskammare som kontinuerligt perfunderas med 35 grader Celsius ACSF och stabilisera skivan.

Med hjälp av DIC optik, fokusera på hörselnerven rot på den tjocka sidan av skivan och använda en micromanipulator för att flytta den bipolär volfram stimulerande elektrod till hörselnerven rot och försiktigt in i ytan av vävnaden. Flytta synfältet till den ventrala kärnan i trapetsoidkroppen på den tunna sidan och välj en medial olivocochlear neuron som mål för patch clamp elektrofysiologi under epifluorescens med hjälp av en 561 nanometer utsläppsfilter. Fyll en inspelning pipett med lämplig intern lösning för det föreslagna experimentet och under DIC optik patch och spela in från den mediala olivocochlear neuron i hela cellen konfiguration.

Justera den elektriska stimulering amplituden av hörselnerven roten för att få konsekventa postynaptic händelser i den mediala olivocochlear neuron. Sedan köra lämpliga stimulering protokoll att observera framkallat synaptic strömmar i mediala olivocochlear nervceller. Denna kil skiva beredning är utformad för att innehålla hörselnerven rot och cochlear kärnan kontralateral till den mediala olivocochlear nervceller riktade för inspelningar.

I denna cresyl violett färgade resektionerade kil skiva cochlear kärnan är närvarande i nästan sin fulla rostral-caudal omfattning. Och hörselnerven roten observeras in i cochlear kärnan. Dessutom innehåller kilskivan nervceller av den mediala kärnan i den trapetsoidkroppen ipsilateral till de mediala olivocochlear nervceller från vilka inspelningar utförs.

För att bekräfta neuronala anslutning inom en kil skiva presynaptic ingångar stimuleras på två sätt. Först är ventrala akustiska stria vid mittlinjen elektriskt stimuleras, aktivera T-stellate axons direkt och den mediala kärnan i trapetsoid kroppen nervceller via klotformiga buskiga cell axon stimulering och resulterar i postynaptic strömmar som mäts vid den mediala olivocochlear neuron. Hörselnerven roten stimuleras sedan att aktivera hela monaural stigande hjärnstammen kretsar och att framkalla postynaptic svar.

Jämförelse av instövning latens åtgärder av den första postynaptic ström framkallat med direkt stimulering av ventrala akustiska stria med de framkallat med auditiva nerv stimulering avslöjar en betydligt längre latens i den auditiva nerv stimulering händelse, vägledande för synaptiska dröjsmål som följer av den ytterligare cochlear nucleus synapse aktiveras under auditiva nerv stimulering. Användningen av anatomiska landmärken och noggrann manövrering av den magnetiska skivan scenen är kritiska för att skapa kil skivor med intakt neuronal kretsar och pålitliga framkallat post synaptic svar. Denna skivningsteknik ger en plattform för att använda ytterligare in vitro elektrofysiologi verktyg inklusive kalcium eller spänning imaging, optogenetik, signalsubstans uncaging, och både intracellulära och extracellulära farmakologi.

Summary

Automatically generated

Integration av olika synaptiska ingångar till nervceller mäts bäst i en beredning som bevarar alla pre-synaptiska kärnor för naturlig timing och krets plasticitet, men hjärnan skivor vanligtvis bryta många anslutningar. Vi utvecklade en modifierad hjärna skiva för att efterlikna in vivo krets verksamhet samtidigt som in vitro experimentförmåga.

Read Article