Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Generering og utvidelse av humane kardiomyocytter fra pasientens perifere blodmonnukleære celler
Chapters
Summary February 12th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her presenterer vi en protokoll for robust å generere og utvide humane kardiomyocytter fra pasientens perifere mononukleære celler i blodet.
Transcript
Dette er omfattende protokollfasiliteter, rå øker generasjonen og bruker pouncing av pasientspesifikke kulturer fra perifere blodmonynukleære celler. Denne taktikken er reproduserbar og enkel å følge, spesielt for nybegynnere. Og krever ikke, spesiell ekspert på stamcelleballader, eller kardiovaskulær medisin.
Vår protokoll kan brukes til å generere pasientspesifikke kardiomyocytter fra en enkelt blodprøve som kan brukes til modellering av kardiovaskulære sykdommer og testing av hjertetoksisitet av nye legemidler. Denne protokollen krever lang tids forpliktelse til omprogrammering av stamceller og rettet differensiering. Imidlertid setter du stor pris på dine bestrebelser.
Når du ser slå kardiomyocytter i parabolen. Når de menneskelige iPSC-koloniene når over 90% samløp, skyll hver brønn med tre milliliter DPBS før du behandler cellene med en milliliter 0,5 millimolar EDTA i DPBS per brønn ved 37 grader Celsius. Etter fem til åtte minutter legger du til en milliliter iPSC-passaging medium til hver brønn og løsner cellene manuelt.
Overfør 600 til 900 mikroliter av cellene til individuelle Brønner har en kjellermembran belagt seks brønnplater for en overnatting inkubasjon ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Oppdater deretter kulturene med to milliliter komplett E8-medium hver dag i tre til fire dager. Når kulturen har nådd samløp, erstatt mediet med to milliliter kardiomyocyttdifferensieringsmedium, to per brønn.
På dag to erstatter du supernatantene med to milliliter kardiomyocyttdifferensieringsmedium en. På dag tre erstatter du supernatantene med to milliliter kardiomyocyttdifferensiering middels tre. På dag fem.
Erstatt supernatanten med to milliliter kardiomyocyttdifferensieringsmedium en. På dag syv til 10 erstatter du supernatanten med to milliliter kardiomyocyttdifferensieringsmedium fire. På dag 11 og 13.
Når kontraktceller observeres, erstatt supernatanten med to milliliter kardiomyocyttdifferensieringsmedium fem. På dag 15, 17, 19 og 21. Erstatt supernatanten med to milliliter kardiomyocyttdifferensieringsmedium fire.
Etter pre-kultur med komplett blod medium per syv dager, PBMC har blitt stor med synlige kjerner og cytoplasma indikerer at de er klar for transfection med Sendai Virus omprogrammering faktorer. Ved introduksjon til komplett E8-medium. De fullstendig omprogrammerte cellene vil feste og begynne å danne kolonier.
Etter fire til fem passasjer vil svært rene iPSC-kolonier dannes fra de omprogrammerte cellene med svært få differensierte celler observert. På dette stadiet er de fleste cellene OCT4 og NANOG positive indikative for deres pluripoteny. Slående kardiomyocytter observeres vanligvis etter 12 dager med differensiering.
Etter glukose sult, og replating iPSC kardiomyocytter utstillinger, spontan juling, og en justert sarcomere struktur med interkalert hjerte troponin T og alfa actinin uttrykk. Koloniene beholder sin renhet som det fremgår av deres Troponin T-uttrykk. Selv om iPSC kardiomyocytter er relativt umodne sammenlignet med voksne kardiomyocytter.
De demonstrerer ventrikulære og atrielignende virkningspotensialer målt ved engros patch, klemme. Ventrikulære kardiomyocytter uttrykker myosinlyskjede to, mens atrie iPSC kardiomyocytter er preget av NR2F2-uttrykk. Wnt-aktivering stimulerer celledeling og fremmer uttrykket av cellesyklusregulatorer.
Interessant nok induserer Wnt-aktivering også den robuste spredningen av tidlige iPSC kardiomyocytter for to passasjer sammenlignet med kontroller, selv om denne proliferative evnen avtar over tid. Forsikre deg om at PBMS forstørres med klar kjernefysisk og cytoplasma før iPSC-omprogrammeringsvektorene introduseres, da tilstanden til PBM-ene er avgjørende for iPSC-omprogrammering. Pasientspesifikke kardiomyocytter er verdifulle for modellering av kardiovaskulær sykdom in vitro og for å gi massevis av donorceller for hjerte stamcellebehandling.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
