इन विट्रो और वीवो अध्ययन में माउस इनवेरियंट नेचुरल किलर टी सेल का शुद्धिकरण और विस्तार

यह प्रोटोकॉल स्याही टी-कोशिकाओं के शुद्धिकरण को सक्षम बनाता है, जो बहुत दुर्लभ हैं, और उनकी संख्या में 30 गुना विस्तार की अनुमति देता है। शुद्धिकरण एक दिन में किया जा सकता है और दो सप्ताह में वीवो और इन विट्रो अध्ययनों में बड़ी संख्या में तैयार स्याही टी-कोशिकाओं का उत्पादन कर सकता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन ग्लोरिया Delfanti, प्रयोगशाला में एक के बाद डॉक्टर होगा ।

माउस तिल्ली विच्छेदन के बाद, यह एक 70 नैनोमीटर सेल छलनी के माध्यम से तोड़ 2% FBS के साथ पीबीएस के 10 मिलीलीटर में एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए। पांच मिनट के लिए ३०० बार जी पर सेंट्रलाइज । सुपरनैंट निकालें और बाँझ अमोनियम क्लोराइड पोटेशियम lysine बफर के एक मिलीलीटर के साथ सेल गोली को फिर से खर्च करें।

कमरे के तापमान पर तीन मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट, तो 2% FBS के साथ PBS के पांच मिलीलीटर के साथ ब्लॉक । पांच मिनट के लिए ३०० बार जी पर सेंट्रलाइज । सुपरनैंट को हटाने के बाद, 2% एफबीएस के साथ पीबीएस के तीन मिलीलीटर में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें और पाइपिंग करके वसा अवशेषों को हटा दें।

संवर्धन चरणों के लिए, कोशिकाओं को ठंडा रखें और समाधान का उपयोग चार डिग्री सेल्सियस पर पूर्व ठंडा करें और फिर बर्फ पर रखा जाए। पांच मिनट के लिए ३०० बार जी पर सेंट्रलाइज । 2% एफपीएस और एफसी अवरोधक के साथ पीबीएस की उचित मात्रा में सभी कोशिकाओं को फिर से खर्च करें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।

10 मिलियन कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र प्रति 10 मिनट के लिए 300 बार जी पर एमएस जुदाई बफर के एक से दो मिलीलीटर के साथ धोएं। सुपरनैक्ट को हटाने के बाद, सीडी 19-फिटसी और एच2-आईएब-फिटसी के साथ कोशिकाओं को दाग दें और अंधेरे में 15 मिनट के लिए चार से आठ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 10 मिलियन कोशिकाओं पर एमएक्स बफर के एक से दो मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धोएं और 10 मिनट के लिए 300 बार जी पर अपकेंद्रित्र करें।

सुपरनेट निकालें और प्रति 10 मिलियन कोशिकाओं में एमएक बफर के 90 माइक्रोलीटर में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें। प्रति 10 मिलियन कोशिकाओं में एंटी-फिटसी माइक्रोमोतियों के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें। चार से आठ डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 15 मिनट के लिए अच्छी तरह से मिलाएं और इनक्यूबेट करें।

10 मिलियन कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र के प्रति 10 लाख कोशिकाओं पर MACS बफर के एक से दो मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए 300 बार जी पर धोएं। सुपरनिटेंट निकालें और एमएक बफर के 500 माइक्रोलीटर में 125 मिलियन कोशिकाओं तक पुनर्व्यवसित करें। एमएसीसी सेपरेटर के चुंबकीय क्षेत्र में एलडी कॉलम रखें।

क्लोजिंग से बचने के लिए एलडी कॉलम पर प्री-सेपरेशन फिल्टर लगाएं और इसे दो मिलीलीटर एमएसी बफर से कुल्ला करें । सेल सस्पेंशन को फिल्टर पर लागू करें और कॉलम से गुजरने वाली अवेलेबल कोशिकाओं को इकट्ठा करें। खाली कॉलम जलाशय को मैक्स बफर के एक मिलीलीटर के साथ तीन बार धोएं।

टी-सेल समृद्ध बहिस्त्राव को इकट्ठा करें और कोशिकाओं की गिनती करें, FACS विश्लेषण के लिए 50 माइक्रोलीटर रखते हुए। पांच मिनट के लिए 300 बार जी पर अपकेंद्री के बाद, सुपरनैंट निकालें और सीडी1डी टेट्रामर-पीई के साथ कोशिकाओं को दाग दें। बर्फ पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए अच्छी तरह से मिलाएं और इनक्यूबेट करें।

प्रति 10 मिलियन कोशिकाओं में एक से दो मिलीलीटर एमएएक्स बफर जोड़कर कोशिकाओं को धोएं। 10 मिनट के लिए 300 बार जी पर अपकेंद्रित्र के बाद, सुपरनेट को हटा दें और प्रति 10 मिलियन कोशिकाओं में एमएएक्स बफर के 80 माइक्रोलीटर में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें। प्रति 10 मिलियन कोशिकाओं में एंटी-पीई माइक्रोमोतियों के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें।

चार से आठ डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 15 मिनट के लिए अच्छी तरह से मिलाएं और इनक्यूबेट करें। 10 मिलियन कोशिकाओं पर एमएक्स बफर के एक से दो मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धोएं और 10 मिनट के लिए 300 बार जी पर अपकेंद्रित्र करें। सुपरनिटेंट निकालें और एमएक बफर के 500 माइक्रोलीटर में 100 मिलियन कोशिकाओं तक पुनर्व्यवसित करें।

सेल काउंट के मुताबिक, एलएस या एमएस कॉलम को एमएएसएस सेपरेटर के मैग्नेटिक फील्ड में रखें और मैक्स बफर के साथ कॉलम को कुल्ला करें । कॉलम पर सेल निलंबन लागू करें, अवेलेबल कोशिकाओं को इकट्ठा करें जो पहले वर्णित कॉलम को तीन बार धोते हैं। यह नकारात्मक अंश है।

चुंबकीय क्षेत्र से कॉलम निकालें और इसे एक नए संग्रह ट्यूब पर रखें। स्तंभ पर पिपेट मैक बफर और इंक टी-कोशिकाओं में समृद्ध सकारात्मक अंश को बाहर निकालने के लिए प्रदान किए गए प्लंजर को कॉलम में धकेल दें। इंक टी-सेल रिकवरी को और बढ़ाने के लिए, 10 मिनट के लिए 300 गुना जी पर नकारात्मक अंश को अपकेंद्रित्र करें और एक नए एलएस या एमएस कॉलम के साथ पिछले चरणों को दोहराएं।

सकारात्मक अंश खींचो और सेल गिनती निर्धारित करते हैं। शुद्धता की जांच करने के लिए FACS विश्लेषण के लिए सकारात्मक और नकारात्मक दोनों अंशों के 50 माइक्रोलीटर रखें। एक-से-एक अनुपात में इंक टी कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए, एंटी-सीडी 3 और सीडी 28 चुंबकीय मोतियों की उचित मात्रा को एक ट्यूब में स्थानांतरित करें और पीबीएस की बराबर मात्रा में, फिर पांच सेकंड के लिए भंवर।

ट्यूब को एक मिनट के लिए चुंबक पर रखें और सुपरनेट को त्याग दें। चुंबक से ट्यूब निकालें और आरपीएमआई की उचित मात्रा में धोया चुंबकीय मोतियों को फिर से खर्च करें। सेंट्रलाइज ने पांच मिनट के लिए 300 बार जी पर इंक टी-कोशिकाओं को शुद्ध किया और उन्हें माउस टी-एक्टिवेटर एंटी-सीडी 3 या सीडी28 चुंबकीय मोतियों के साथ मिलाएं।

सेल निलंबन के एक मिलीलीटर प्लेट, विरोधी CD23 और CD28 चुंबकीय मोती एक ४८ में अच्छी तरह से थाली प्रति मिलीलीटर आईएल-2 प्रति 20 इकाइयों के साथ, तो ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट । पांच दिनों के बाद, 10 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर आईएल-7 जोड़ें। कोशिकाओं को आधे में विभाजित जब वे ८० से ९०% संगम तक पहुंचने, हमेशा मिलीलीटर आईएल-2 प्रति 20 इकाइयों और मिलीलीटर आईएल-7 प्रति 10 नैनोग्राम जोड़ने ।

इन परिस्थितियों में, स्याही टी-कोशिकाओं को 15 दिनों तक विस्तारित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, इंक टी-कोशिकाओं को इम्यूनोमैग्नेटिक पृथक्करण प्रक्रिया के माध्यम से ट्रांसजेनिक चूहों की तिल्ली से समृद्ध किया जाता है। संवर्धन के बाद, कोशिकाओं को विरोधी CD3 और CD28 मोतियों के साथ विस्तारित किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप संस्कृति के दिन 14 से औसतन 30 गुना विस्तार होता है।

एंटी-सीडी 3 और एंटी-सीडी मोतियों के साथ मजबूत सक्रियता ने कोशिका की सतह पर आईएमके टी-सेल टीसीआर अभिव्यक्ति के डाउनरेगुलेशन को प्रेरित किया और एक डबल नकारात्मक आबादी दिखाई दी। विस्तारित स्याही टी कोशिकाओं के बहुमत CD4 नकारात्मक हैं। वंश-विशिष्ट प्रतिलेखन कारकों के लक्षण वर्णन पीएलजेडएफ और आरओआर गामा टी ने दिन शून्य और 14 में समृद्ध इंक टी-कोशिकाओं पर NKT1, NKT2, और NKT17 फेनोटाइप की पहचान करना संभव बनाया।

समृद्ध स्याही टी-कोशिकाएं एक T80-जैसे प्रभावकार फेनोटाइप दिखाती हैं, जिसे विस्तार के 14 दिनों के बाद संरक्षित किया जाता है जैसा कि पीएमए और आयनोमाइसिन उत्तेजना के बाद इंटरफेरॉन गामा और आईएल-4 दोनों के स्राव से पुष्टि की जाती है। शुद्धिकरण चरणों के दौरान, प्री-कूल्ड समाधानों के साथ तेजी से काम करना याद रखें और किसी भी वसा अवशेषों से छुटकारा पाएं जो पाइपिंग करते समय देखे जा सकते हैं। विस्तारित स्याही टी-कोशिकाओं का इन विट्रो परखों और वीवो स्थानान्तरण में चूहों में, जीन हस्तांतरण या संपादन के माध्यम से कार्यात्मक संशोधनों के बाद भी शोषण किया जा सकता है।

इंक टी-कोशिकाओं के विट्रो विस्तार में कमी द्वारा दी गई सीमा पर काबू पा लिया जाता है, जिससे उन्हें ट्यूमर प्रतिरक्षा निगरानी, संक्रामक रोगों और ऑटो-प्रतिरक्षा के क्षेत्रों में प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में शोषण योग्य बना दिया जाता है।