A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Koyunlarda Erişkin ve Prepubertal Yumurtalıklardan Toplanan In Vitro Olgunlaşmış Oositlerin Vitrifikasyonu
Chapters
Summary July 10th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Protokol, yetişkin ve yavru koyun oositlerinin vitrifikasyonu için standart bir yöntem sağlamayı amaçlamaktadır. Tüp bebek medyasının hazırlanmasından ısınma sonrası kültüre kadar tüm adımları içerir. Oositler, minimum temel hacmi sağlamak için Cryotop kullanılarak MII aşamasında vitrifiye edilir.
Transcript
Uzun süreli depolamadan sonra oosit potansiyelinin canlılığının korunması, genetik seçim programlarının evcil hayvan yetiştiriciliğini geliştireceği, yaban hayatı türlerinin korunması yoluyla biyoçeşitliliğin korunmasına katkıda bulunacağı ve biyoteknoloji araştırmalarını artıracağı için büyük bir fırsat aracını temsil ediyor. Juvenil oosit vitrifikasyonu üreme programlarında nesil aralığında çok daha kısaydı. Ultrarapid soğutma ve ısınma ile vitrifaction sığır oosit korunmasında standart bir yaklaşım olarak kabul edilir.
Bununla birlikte, koyunlarda bu prosedür hala nispeten yeni olarak kabul edilir ve standart bir yöntem eksiktir. Bu videoda, hem genç hem de yetişkin donörlerden toplanan ve in vitro kriyoprezervasyondan önce olgunlaşan koyun oositinin vitrifikasyonu için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, in vitro olgunlaşma, vitrifikasyon, ısınma ve ısınma sonrası kültürden tüm prosedürleri içerir.
Kümülüs oosit kompleksini geri aldıktan sonra, 24 saat boyunca in vitro olarak olgunlaştırılarak, olgunlaşma ortamında yüz mikromolar trehaloz ile takviye, juvenil oosit için dahil bir durum. İn vitro olgunlaşmayı takiben, oositler Kümülüs hücrelerinin hafifçe pipetlenmesiyle mekanik olarak inküre edildi ve stereo mikroskop altında 60x büyütme ile incelendi. Vitrifikasyon prosedürlerinde sunacak oositlerin seçimi, bu prosedürün başarılı bir şekilde uygulanmasını garanti etmek için ilk önemli adımı temsil eder.
Sadece tek tip sitoplazma olanlar, lipit damlacıklarının homojen dağılımı, uzayda tüm Emma geniş ve sürekli pivotal bütünlüğü, kompakt zona pellucida yaklaşık 19 mikrometre dış çapı ve ilk kutup gövdesinin ekstrüzyonunu gösteren ve böylece M2'de aşama seçilmelidir. Vitrifikasyon, bir Cryotops cihazı ile minimum temel hacim yöntemi kullanılarak gerçekleştirildi. Seçimden sonra, beş çocuk oosit grubu iki dakika boyunca taban ortamında 38,5 santigrat derecede koşullandırılmıştır.
Oositler daha sonra bir kalibrasyon çözeltisine üç dakika maruz kalıtsal maruz kalıtsal olarak susuz kaldı. Oositlerin kullanılan vitrifikasyon cihazına yüklenmesi önemli ve kritik bir adımdır. Kriyotop, tutucuya bağlı bir polipropilen şerit kullanır.
Bu yöntemde, vitrifikasyon çözeltisinde, 0 puan mililitreden daha az olan oositler, film şeridinin üzerine hızla cam bir kılcal damar ile yüklenir. Daha sonra çözelti çıkarılmalı ve geride kriyoprezerserve edilecek hücreleri kaplayacak kadar ince bir tabaka bırakılmalıdır. Cryotop cihazına yüklenmeden ve 30 saniye içinde doğrudan sıvı nitrojene dalmadan önce.
Sıcak iç biyolojik sıcaklık için, her vitrifikasyon cihazının içeriği sıvı azottan azalan trehaloz çözeltisinin 200 mikroliter damlasına aktarıldı. Oositler, intracelular kriyoprotektantların çıkarılmasını teşvik etmek için oositleri ince, cam pipetle sürükleyerek aktarıldı. Son olarak, oositler% 5 karbondioksitte inkübatörde bir baz ortamda önceden yetiştirildi.
Isınmadan hemen sonra ve ısınma sonrası kültürün her zaman noktası için, oositler 100x büyütmeli ters bir mikroskop kullanılarak morfolojik olarak değerlendirildi. Çocuk donörlerden gelen oositlerin kriyo toleransı, ısındıktan sonra daha düşük membran bütünlüğüne sahip değiştirilmiş olanlara kıyasla daha düşüktür. Juvenil oositlerde indüklenen olgunlaşma ortamında trehaloz kullanımı daha yüksek membran bütünlüğünü artırarak vitrifikasyon sonrası sağkalım oranlarını artırır.
Ancak trehaloz takviyesi ile rekolte, döllenme ve juvenil oositlerin gelişim oranları artmamıştır. Juvenil oositlerin vitrifikasyonu için 2,2 miligram desilitreye eşit kalsiyum konsantrasyonuna sahip ortamların kullanımı, kalsiyum konsantrasyonu ile vitrifiye edilen oositlere kıyasla daha yüksek döllenme oranlarına sahip olmalıdır, ancak üretimi sağlayan herhangi bir farklılık bulunamadı. Isınma sonrası kültürü farklı sürelerde karşılaştırarak, yaşlı iki kişiden toplanan dört saatlik kültür oositinden sonra enerjik bağları ve mikrotübüler kurulumu geri kazanabildiğini ve daha yüksek dekolte ve blastosit atıkları ile gelişimsel yetkinliği geri kazanabildiğini gösterdik.
Mitokondriyal aktivite, dört saatlik ısınma sonrası kültürden sonra diğer zaman noktalarına kıyasla vitrifiye sıcak juvenil oositlerde daha yüksekti. Mitokondriyal dağılım ayrışması da altı saatlik ısınma sonrası kültür sırasında değişti. Ayrıca, reaktif oksijen türleri hücre içi düzeyleri, ıslah edici oositlerde ısınma sonrası kültürün iki saatinde 0, 4 ve 6 saate kıyasla önemli ölçüde daha düşüktü.
Bununla birlikte, diğer oositlerde bulunanların aksine, juvenil oositlerde ısınma sonrası kültür sırasında spontan partenogentik aktivasyon oranları artmıştır. Önerilen yöntemin ana avantajlarından biri, oosit toplanmasından in-vitro olgunlaşmaya, vitrifikasyona ve ısınmaya kadar tüm adımları içermesidir. Ayrıca, vitrifikasyon prosedürü sırasında oluşan hasarlardan oosit iyileşmesine izin vermek için ısınma sonrası bir kültür dönemi içerir.
Döllenme için en uygun zamanı seçmek zordur ve vitrifikasyon programının sonucunu etkileyebilir. Yavaş dondurmanın aksine, vitrifikasyonun manuel bir teknik olduğu ve bu nedenle operatöre bağlı olduğu da düşünülmelidir. Bu nedenle, vitrifikasyon programının sonucunun değerlendirilmesinde operatör etkisini dikkate alan yetenekli teknisyenlere ve araştırmacılara duyulan ihtiyaç büyük bir zorluktur.
Laboratuvarımızdan daha fazla çalışma, oosit vitrifikasyon prosedürünü ve seçimini standartlaştırmaya ve medya kompozisyonunu juvenil oosit ihtiyaçlarına daha iyi uyarlamaya izin verecektir. Kültür ve karakter kullanımı ve antioksidan kullanımı hakkında bir ihmal umut verici fırsatlar sunuyoruz.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
