Biology
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न्यूट्रॉन स्पिन इको स्पेक्ट्रोस्कोपी लिपिड झिल्ली गतिशीलता और झिल्ली-प्रोटीन इंटरैक्शन के लिए एक अद्वितीय जांच के रूप में
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यह पेपर लिपिड झिल्ली के न्यूट्रॉन स्पिन इको (एनएसई) अध्ययनों में नमूना तैयारी, डेटा में कमी और डेटा विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। लिपिड के विवेकपूर्ण ड्यूटेरियम लेबलिंग मेसोस्कोपिक लंबाई और समय तराजू पर विभिन्न झिल्ली गतिशीलता तक पहुंच को सक्षम बनाता है, जिस पर महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाएं होती हैं।
Transcript
यह प्रोटोकॉल जैविक कार्यों और लिपिड झिल्ली के व्यावहारिक अनुप्रयोगों के लिए प्रासंगिकता के सामूहिक झिल्ली उतार-चढ़ाव के सफल न्यूट्रॉन स्पिन इको अध्ययनों के लिए आवश्यक नमूना तैयारी और डेटा कमी का वर्णन करता है। एनएसई सीधे चुनिंदा झिल्ली की जांच के लिए आइसोटोप संवेदनशीलता के अद्वितीय लाभ के साथ प्रमुख झिल्ली कार्यों के नैनोसेकंड टाइमस्केल पर झिल्ली गतिशीलता तक पहुंचता है अन्य तकनीकों के साथ दुर्गम है। नैनोस्केल पर झिल्ली गतिशीलता के अध्ययन आणविक तंत्र के अंतर्निहित झिल्ली गुणों और विभिन्न कोशिका विकृतियों में फंसा झिल्ली-प्रोटीन बातचीत को समझने के लिए आवश्यक हैं।
विधि शोधकर्ताओं को एनएसई के लिए नए डिजाइन, तैयारी, और सफल प्रयोगों और बाद में डेटा में कमी विश्लेषण और व्याख्या के लिए लिपिड vesicles विशेषता पर विस्तृत दिशा निर्देशों के साथ प्रदान करता है । प्रक्रिया का प्रदर्शन टेशानी कुमारेज और जूली गुयेन, एक स्नातक छात्र और प्रयोगशाला से एक स्नातक छात्र होगा । एक हुड के अंदर काम करना, मैनुअल मिश्रण के साथ सॉल्वेंट के एक मिलीलीटर में सही तौला लिपिड को भंग करके लिपिड निलंबन तैयार करें।
धीरे-धीरे एक कोण पर घूर्णन करते हुए शीशी में एक निष्क्रिय गैस स्ट्रीमिंग द्वारा लिपिड समाधान सुखाएं। अवशिष्ट विलायक को अच्छी तरह से हटाने के लिए, 35 डिग्री सेल्सियस पर वैक्यूम ओवन में रात भर शीशियों को रखें। अगले दिन, लिपिड फिल्म को 50 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर की लिपिड एकाग्रता प्राप्त करने के लिए भारी पानी के दो मिलीलीटर के साथ लिपिड फिल्म को हाइड्रेट करें और लिपिड फिल्म पूरी तरह से भंग होने तक हाइड्रेटेड लिपिड निलंबन को हाइड्रेट करें।
इसके बाद, जमे हुए तक शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर हाइड्रेटेड लिपिड निलंबन की शीशी को संग्रहीत करके पांच फ्रीज-गल चक्र करें। और फिर यह एक ३५ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान करने के लिए लिपिड निलंबन गल करने के लिए स्थानांतरित । भंवर अगले चक्र के लिए आगे बढ़ने से पहले समरूप जब तक गल निलंबन ।
प्रयोग शुरू करने से पहले, दो झिल्ली के समर्थन के बीच पॉली-बाइकार्बोनेट झिल्ली का उपयोग करके एक्सट्रूडर सेटअप को इकट्ठा करें और अतिरिक्त सहायता प्रदान करने के लिए प्रत्येक तरफ दो पेपर फिल्टर जोड़ें। कई बार झिल्ली असेंबली के माध्यम से भारी पानी के 0.3 मिलीलीटर पारित करके पॉली कार्बोनेट झिल्ली को हाइड्रेट करने के लिए एयरटाइट ग्लास सीरिंज का उपयोग करें। झिल्ली को हाइड्रेटिंग करने के बाद, एक एक मिलीलीटर गैस-तंग सिरिंज को एक छोर में तैयार दूधिया सफेद रंग लिपिड समाधान और एक्सट्रूडर उपकरण के विपरीत छोर में एक खाली सिरिंज डालें।
एक बार सीरिंज कनेक्ट होने के बाद विधानसभा को एक्सट्रूडर ब्लॉक में रखें। एक्सट्रूशन रेट दर्ज करने के लिए रेट बटन को दबाकर पंप को प्रोग्राम करें और सिरिंज व्यास में प्रवेश करने के लिए व्यास बटन दबाएं। फिर, जब तक प्रकाश चालू नहीं हो जाता तब तक दबालें।
प्रेस शुरू करें और नमूने को खाली सिरिंज में वितरण शुरू करने का इंतजार करें। सैंपल सिरिंज पूरी तरह खाली होने से ठीक पहले स्टॉप बटन मारो। डिस्पेंस किए गए वॉल्यूम को रिकॉर्ड करें, फिर स्क्रीन पर फेज वन दिखाई देने तक रेट बटन को होल्ड करें।
वापस लेने की रोशनी को बंद रखते हुए, पहले दर्ज की गई तिरस्कृत मात्रा को दर्ज करने के लिए वॉल्यूम बटन दबाएं। दर बटन को फिर से दबाएं और चरण दो तक पहुंचने के लिए सही सबसे ऊपर तीर का उपयोग करें। पहले दर्ज की गई तिरस्कृत मात्रा के समान मूल्य में प्रवेश करने के लिए वॉल्यूम दबाएं।
इस चरण में, वापस लेने का बटन तब तक दबाएं जब तक कि वापस लीव लाइट चालन न हो जाए। एलपी तक वॉल्यूम बटन दबाकर चरण तीन के लिए चक्र दोहराएं: एसई स्क्रीन पर दिखाई देता है और इसे 20 में सेट करता है। अंत में, रेट बटन दबाएं, चरण चार तक पहुंचें, और पंप सेटअप को खत्म करने के लिए स्टॉप फ़ंक्शन तक पहुंचने के लिए वॉल्यूम बटन को हिट करें।
पंप प्रोग्राम होने के बाद, एक्सट्रूशन चक्र शुरू करने के लिए प्रेस स्टार्ट करें। माप के लिए एक साफ शीशी में पारदर्शी ओपल ब्लू एक्सट्रूडेड लिपिड निलंबन इकट्ठा करने से पहले 15 से 20 एक्सट्रूशन चक्र करें। डेव सॉफ्टवेयर खोलें और डेटा रिडक्शन मेनू से एनएसई डेटा को कम करें।
फ़ाइल मेनू से ओपन इको फाइलों का उपयोग करके डेटा फ़ाइलों को विभिन्न क्यू-मानों पर अपलोड करें। अपलोड की गई फाइलें उपलब्ध डेटा सेट के तहत दिखाई देंगी। चयनित फ़ाइल पर सही क्लिक करें और इसे माप के अनुसार लेबल करें जो नमूना, सेल या रिज़ॉल्यूशन की तरह मेल खाता है।
डेटा सेट टैब का उपयोग करके, सिग्नल टू शोर अनुपात को बेहतर बनाने के लिए 2 X 2 में डिटेक्टर पिक्सल को समूहित करें। संकल्प, सेल और नमूना की सभी फाइलों पर एक ही बिनिंग लागू करें। सभी पिक्सेल समूहों पर डेटा का निरीक्षण करें और कीबोर्ड पर अंत कुंजी दबाकर खराब संकेतों वाले लोगों को मास्क करें।
अपने सभी चार समय के लिए एक ही मुखौटा लागू करने के लिए एक पॉप-अप विंडो का उपयोग करने के लिए प्रेस दर्ज करें। नकाबपोश पिक्सल हरे रंग की हो जाएगी। सुनिश्चित करें कि एकत्र किए गए डेटा इको सिग्नल के रूप में हैं।
वांछित फ़ाइल पर सही क्लिक करके और फिट ऑपरेशंस का चयन करके अपलोड की गई फ़ाइल सूची से संकल्प फ़ाइल को फिटिंग शुरू करें, पॉप-अप मेनू से फिट इकोज़ रिज़ॉल्यूशन। सुनिश्चित करें कि इको सिग्नल के फिट उचित फिटिंग पैरामीटर निकलते हैं। पूरे डिटेक्टर पर प्रत्येक फिटिंग पैरामीटर से जुड़ी त्रुटि का निरीक्षण करने के लिए, छवि विकल्पों का चयन करें, और फिर ब्याज के फिटिंग पैरामीटर का चयन करें।
फिर, एक त्रुटि बार नक्शा दिखा एक पॉप अप खिड़की का उपयोग करने के लिए डिटेक्टर छवि पर सही क्लिक करें । यदि किसी विशिष्ट पिक्सेल पर फिट असंतोषजनक है, तो उस पिक्सेल पर सिग्नल को चुनकर, फिटिंग टैब दबाकर और फिर फिट पिक्सेल को दबाकर फिर से फिट करें। फिटिंग टैब में चरण और अवधि के लिए नए शुरुआती मापदंडों को इनपुट करें।
अपलोड और लेबल की गई फाइल सूची से संबंधित फ़ाइल का चयन करके नमूना फ़ाइल को कम करें। ऊपर वर्णित सभी पिक्सेल का निरीक्षण करें और गरीब लोगों को मास्क करें। फिर, फ़ाइल पर सही क्लिक करें और फिट ऑपरेशंस, आयात चरणों का चयन करें।
संकल्प फ़ाइल के लिए, संकल्प से आयातित अवधि अपरिवर्तित और इको चरण बिंदु के मूल्यों के साथ पहले वर्णित के रूप में फिट इको सिग्नल फिट बैठता है। जनरल टैब तक पहुंचने और प्रयोग से दर्ज एक्स और वाई बीम केंद्र मूल्यों में प्रवेश करके सभी डेटा फ़ाइलों के लिए बीम केंद्र इनपुट करें। एक बार फिट होने के बाद, फिट फ़ाइलों की सूची से वांछित नमूना फ़ाइल पर सही क्लिक करके सामान्यीकृत मध्यवर्ती बिखरने वाले फ़ंक्शन की गणना करें और पॉप-अप मेनू से क्यू की गणना I का चयन करें।
रिज़ॉल्यूशन और सेल फ़ाइलों के लिए आवश्यक जानकारी दर्ज करें और पॉप-अप विंडो में क्यू-आर्क्स की संख्या, फिर परिणाम देखने के लिए ठीक दबाएं। ध्यान दें कि सियान में डेटा डिटेक्टर एज प्रभावों के कारण खराब संकेत दिखाता है और विभिन्न क्यू डेटा सेटों को संकलित करते समय समाप्त किया जाना चाहिए। अंत में, एएससीआईआई फाइलों के रूप में कम डेटा सेट को सहेजें और वांछित फ़ोल्डर में डेव परियोजना के रूप में पूरे सत्र को सहेजें।
इस अध्ययन में अलग-अलग ड्यूटेरेशन योजनाओं से तैयार लिपोसोमल नमूनों के एनएसई माप किए गए। झिल्ली झुकने वाले उतार-चढ़ाव के एनएसई माप पूरी तरह से विपरीत लिपोसोम पर किए जाते हैं। इस ड्यूटेरेशन योजना के परिणामस्वरूप झिल्ली कोर और ड्यूटेरेटेड द्रव वातावरण के बीच एक बड़ा बिखरने वाली लंबाई अंतर होता है, जो लिपोसोमल झिल्ली से बिखरने वाले संकेत को काफी बढ़ाता है और झुकने वाली गतिशीलता के माप आंकड़ों में सुधार करता है।
दूसरी ओर, लिपोसोम्स की झिल्ली मोटाई के उतार-चढ़ाव के एनएसई माप क्यू के सापेक्ष विचलन को मोड़ने के उतार-चढ़ाव की तीसरी निर्भरता के सापेक्ष दिखाते हैं। मोटाई में उतार-चढ़ाव के संकेत को अलग करने के लिए, प्राप्त संकेत को क्यू से तीसरे तक विभाजित किया जाता है और अतिरिक्त गतिशीलता Q.In में एक लोरेनट्ज़ियन समारोह में फिट होती है। यह विधि अच्छी गुणवत्ता वाले डेटा पर आकस्मिक है, जो उच्च सांद्रता और मजबूत बिखरने वाले संकेतों के नमूनों के साथ अधिक प्राप्त की जाती है। एनएसई द्वारा जांच की गई गतिशीलता को ड्यूटेरियम एनएमआर रिलैक्सोमेट्री और आणविक-गतिशील सिमुलेशन द्वारा सहक्रियात्मक रूप से खोजा जा सकता है ताकि यह समझा जा सके कि आणविक लिपिड संरचनाएं और पैकिंग रूपांकन झिल्ली कार्यों को कैसे प्रभावित करते हैं।
लिपिड झिल्ली पर एनएसई अध्ययन झिल्ली बायोफिजिक्स, झिल्ली संरचना और गतिशीलता के जटिल संबंधों पर नई रोशनी डाला, और कैसे वे झिल्ली कार्यों और झिल्ली प्रोटीन बातचीत को प्रभावित करते हैं ।
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जीव विज्ञान अंक 171 सामूहिक लिपिड गतिशीलता झुकने वाले मॉड्यूलस क्षेत्र संपीड़न मोटाई में उतार-चढ़ाव झिल्ली चिपचिपाहट चयनात्मक ड्यूटेरेशन लिपोसोम तैयारीRelated Videos
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