Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Genomomfattande analys av fördelning av histonmodifieringar med hjälp av chromatinimmunprecipitationssekvenseringsmetoden i Magnaporthe oryzae
Chapters
Summary June 2nd, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Här presenterar vi ett protokoll för att analysera genomomfattande fördelning av histonmodifieringar, som kan identifiera nya målgener i patogenesen vid M. oryzae och andra filamentösa svampar.
Transcript
Denna metod kan hjälpa till att belysa de molekylära mekanismerna bakom regleringen av kandidatmålgener via epigenetiska modifieringar under svamppatogenes i växtpatologi. Chromatin immunoprecipitation sekvensering teknik kan effektivt upptäcka DNA segment som interagerar med histoner och transkription faktorer i hela genomet. Jämfört med andra metoder kan det förbättra effektivitet och upplösning.
Börja med att tillsätta 100 mikroliter flytande komplett medium till havregrynstomaten Agger-tallrikar med en 100 mikroliterpipett. Skrapa mycelia av den vilda typstammen och knockoutstammen med hjälp av en inokuleringsslinga. Samla mycelia skräp och överföra dem till 250 milliliter flytande komplett medium.
Tvätta svamphyfaen med 500 milliliter 0,7 molar natriumkloridlösning. Samla sedan svampmyceliUM och väg den. Tillsätt ungefär en milliliter lys enzympermeationslösning per ett gram av svampmyceliet.
Placera hyphae för att licing på 28 grader Celsius i tre till fyra timmar med skakningar vid 150 RPM. Tvätta den licerade hyfaen med 50 milliliter 0,7 molar natriumkloridlösning. Centrifuga provet och kassera supernaten försiktigt.
Suspendera protoplasten igen i 20 milliliter 0,7 molar natriumkloridlösning. Tillsätt 55 mikroliter 37% formaldehydd droppe för droppe till två milliliter natriumkloridbuffert som innehåller protoplaster för korslänkning tills den slutliga koncentrationen är 1%För att släcka den oredovisade formaldehyden, tillsätt 20 mikroliter 10 gånger glycin till varje rör. Kassera supernatanten försiktigt efter centrifugation.
Suspendera pelleten igen i en milliliter 0,7 molar natriumkloridlösning. Kassera supernatanten försiktigt efter centrifugering och sätt tillbaka pelleten i 750 mikroliter RIPA-buffert. Tillsätt 37,5 mikroliter med 20 gånger proteashämmare.
Shear kromatin genom ultraljudsbehandling i åtta minuter med hjälp av en ultraljud homogenisator. När provet har brutits ultraljud, ta ut en del av provet som insats som innehåller allt DNA och protein som frigörs efter att provet har sonats. För att analysera längden på DNA-fragmenten, kör en 1%agarose gel elektrofores efter ultraljudsbehandling.
Efter centrifugering, överför centrifugerad supernatant till ett 1,5 milliliter centrifugeringsrör och förvara det vid negativa 80 grader Celsius för senare användning. Innan du utför IP-experimentet, späd varje kromatinprov till ett förhållande av ett till tio med en gånger RIPA-buffert. Pipett 50 mikroliter superparmagnetiska proteinpärlor i ett två milliliter centrifugeringsrör.
Placera rören på ett magnetiskt stativ och låt magnetpärlorna fällas ut. Ta sedan bort supernaten. Tillsätt en milliliter förkylda en gång RIPA-buffert till röret och tvätta superparmagnetiska proteinpärlor tre gånger.
Placera rören på ett magnetiskt stativ och ta bort supernaten. Tillsätt 100 mikroliter av en gånger RIPA-buffert till varje rör. Tillsätt 30 mikroliter av kromatinprovet, 100 mikroliter superparmagnetiska proteinpärlor och fyra mikroliter H3K4me3-antikroppar i röret och blanda dem väl.
Placera proverna på en roterande skakapparat för att inkubera dem över natten vid fyra grader Celsius vid 30 gånger G.Tvätta den superparmagnetiska proteinpärlans antikropp och kromatinkomplex genom att återanvända pärlorna i en milliliter av en gånger RIPA-buffert. Tvätta provet med en milliliter låg salt immun komplex tvättbuffert, sedan med en milliliter hög salt immun komplex tvättbuffert. Skölj pärlorna med en milliliter litiumkloridbuffert och ta bort supernatanten.
Lägg sedan till en milliliter TE-buffert i röret. Placera röret igen med en milliliter TE-buffert och ta bort supernaten med en pipett. Tillsätt 100 mikroliter elueringsbuffert till varje centrifugrör.
Utför eluering vid 65 grader Celsius i 15 minuter. Centrifug i en minut vid 10 000 gånger G vid fyra grader Celsius och samla supernaten i nya centrifuger. Tillsätt åtta mikroliter av fem molar natriumklorid till alla rör och inkubera vid 65 grader Celsius i fyra till fem timmar eller över natten för att vända DNA-proteinet korslänkar.
Tillsätt en mikroliter Rnase A och inkubera i 30 minuter vid 37 grader Celsius. Tillsätt fyra mikroliter proteinas K till varje rör och inkubera vid 45 grader Celsius i en till två timmar. Tillsätt 550 mikroliter fenalklorid- och isoamylalkoholblandningen i centrifugröret.
Centrifug i 15 minuter vid 10 000 gånger G och aspirera supernaten. Tillsätt 1/10 volym av tre molar natriumacetatlösning, 2,5 volymer absolut etanol och tre mikroliter glykogen till röret. Placera provet i kylskåp vid minus 20 grader Celsius över natten för nederbörd.
Nästa dag centrifugeras rören och supernaten kasseras. Tvätta pelleten tre gånger med en milliliter nyberedd 75% etanol vid 10 000 gånger G.Add 50 mikroliter sterilt avjoniserat vatten för att tillräckligt lösa upp fällningen. Reparera DNA-ändarna för att generera trubbigt slut DNA med hjälp av ett DNA-slutreparationskit och instruktioner som nämns i textmanuskriptet.
För att lägga till adeninbasis till de tre främsta ändarna, tillsätt 30 mikroliter DNA, två mikroliter vatten, fem mikroliter med 10 gånger Taq-buffert, 10 mikroliter av en millimolar dATP och tre mikroliter Taq DNA-polymeras till ett 0,2 mikroliter PCR-centrifugerör. Blanda dem och reagera i en PCR-maskin vid 72 grader Celsius i 10 minuter. Utför linker ligatur genom att blanda 10 mikroliter DNA, 9,9 mikroliter vatten, 2,5 mikroliter T4 DNA-ligasbuffert, 0,1 mikroliter adapter oligoblandning och 2,5 mikroliter T4 DNA-ligas i ett 0,2 mikroliter PCR-centrifugerrör.
Inkubera röret vid 16 grader Celsius i fyra timmar. För att förstärka DNA med PCR-primers, tillsätt 10,5 mikroliter DNA, 12,5 mikroliter två gånger hög återgivningsmästarblandning. en mikroliter PCR primer PE 1.0 och en mikroliter PCR primer PE 2.0 till ett 0,2 mikroliter PCR centrifuge rör och blanda väl.
H3K4me3 signaler av mobre2, mospp1 och moswd2 borttagning mutanter minskade betydligt i dess funktionella mål regioner. Jämfört med den vilda typ stam P131, signalerna av berikade H3K4me3 chromatin immunoprecipitation sekvensering läser i mobre2, mospp1 och moswd2 borttagning mutanter minskades i stor utsträckning. Efter denna procedur kan chip på chip och chip qPCR utföras.
De används i allmänhet för att screena målgenen nedströms av ett protein och studera protein-DNA-interaktioner på kända genombindningsställen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
