Biochemistry
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フラグメントベースのリード発見におけるスクリーニングのためのナノ差動走査フルオリメトリー
Chapters
Summary May 16th, 2021
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標的タンパク質の溶融温度の変化をモニタリングする(すなわち、熱シフトアッセイ、TSA)は、数百化合物の断片ライブラリーをスクリーニングするための効率的な方法である。フラグメントスクリーニング用の固有トリプトファン蛍光と光逆散乱をモニタリングするためのロボット工学支援ナノ微分走査蛍光測定(nano-DSF)を実装するTSAプロトコルを発表する。
Transcript
このプロトコルは、有望なフラグメントを熱候補として選択するための追加ツールとして、フラグメント化ベースのリード検出キャンペーンに役立ちます。フラグメントスクリーニング用のナノDSOは、限定された非標識タンパク質サンプルを使用し、ほぼすべてのタンパク質標的に日常的に使用することができます。この方法は、リガンドの任意のコレクションをスクリーニングするために使用することができます。
または他の方法からの熱を確認する。マイナス20度またはマイナス80度の冷凍庫からフラグメントプレートを取り出し、ベンチトップシェーカーで穏やかに揺れて室温で解凍させます。プレートを500倍Gで30秒間遠心し、井戸の側面に付着した滴を集める。
マルチチャネルピペットを使用して、MRC 2ウェル結晶化プレートとピペット15マイクロリットルのタンパク質ストック溶液を各サブウェルに取り込みます。モスキートの断片およびタンパク質プレートの定義を確認するには、ナノディスペンサーのスイッチを入れ、移動するコンポーネントの周りに障害物がないことを確認します。グラフィカルユーザーインターフェイスを開き、[設定]タブをクリックし、[デッキ構成]で、化合物が供給され、タンパク質が転送されたプレートの種類が利用可能なプレートのリストにすでに存在するかどうかを確認します。
それがない場合は、[オプション]をクリックし、[プレート]をクリックして、プロパティ タイプの正しい値を入力して新しいプレート定義を作成します。[設定]タブで、[デッキ構成]の下でプレートの位置を指定します。ドロップダウンメニューを使用して、位置1にグレインなU底プレートを選択し、位置2にMRC 2ウェルプレートを選択し、プロトコルを保存します。
フラグメントプレートを1桁に置き、プロテインプレートをデッキの2桁に配置します。プロトコルタブで、[ファイル]をクリックし、フラグメントを分配するために前の手順で保存したプロトコルを選択します。分配される断片の体積を0.3マイクロリットルとして定義します。
列 1 と 12 の一般的なプレートでは、フラグメントを含まない場合は、開始位置から 2 列目、および列 11 までの終了位置を定義します。プレートによっては、列 2 または 11 が空の場合、列 3 と 10 を開始値と終了値として使用します。[実行] をクリックしてプログラムを起動します。
約2分かかる塗布後、ロボットからタンパク質とフラグメントプレートを取り出し、接着シールフィルムで密封します。タンパク質プレートをGの500倍の30秒間短く遠心し、次のステップに進む前にウェルの側面に付着した任意の滴を収集する。タンパク質プレートの井戸の中で、断片の添加によって発生した可能性のある沈殿物を視覚的に検査します。
沈殿が多くのウェルで観察される場合は、断片の濃度を下げ、実験を繰り返します。プロメテウスの楽器のスイッチを入れて下さい。タッチスクリーンで、引き出しを開いて、器具のキャピラリーローディングモジュールにアクセスします。
ローディングモジュールから磁気ストリップを取り外し、ミラーをエタノールで洗浄して、ほこりを取り除きます。タンパク質断片プレートから毛細血管に溶液を移すには、タンパク質プレートとキャピラーを器具の隣に置いて、キャピラリーローディングモジュールに簡単にアクセスできます。片方の端にキャピラリーを持ち、タンパク質プレートの溶液をキャピラリーのもう一方の端に触れてサンプルを転送します。
手袋は必ず着用し、手袋からの不純物が測定に影響を与えるため、真ん中の毛細血管に触れないようにしてください。キャピラリーをホルダーの指定位置に配置し、正しく位置合わせおよび中央揃えになっていることを確認し、これらの手順を繰り返して、ローディングモジュール内のすべての位置を埋めます。最後に、キャピラリーの上に磁気ストリップを置いて所定の位置に保持し、引き出しを閉じるを押してNano-DSF実験を開始します。
プロメテウスアプリケーションPRを開きます。ThermControlをクリックして新しいプロジェクトを作成し、新しいセッションを開始します。まず、サンプルの蛍光を検出するための探索スキャンを行います。レーザーの励起力を調整して、サンプルの蛍光信号を変化させます。
熱変性の場合は、溶融スキャンタブをクリックし、開始温度を摂氏20度、終了温度を摂氏95度、温度勾配を1分あたり1°Cに設定します。次に、[計測を開始]をクリックします。外側、運動、又は癌1タンパク質において高度に発現した変化および融解温度の周波数分布、単極スピンドルキナーゼ1の調節性テトラトリコペプチド反復ドメイン、およびSARS-CoV-2 3c様プロテアーゼをここに示す。
負の値はフラグメント存在下での溶融温度の低下を示し、正の値は溶融温度の上昇を示します。Nsp5では、すべてのフラグメントに安定化解除効果があるのに対し、Hec1とMps1では、安定化ヒットと安定化解除ヒットの両方が観察されます。これは、フラグメントライブラリをスクリーニングするための安価で迅速な方法です。
NMRやX線結晶学などの他の方法は、断片の正確な結合を示し、INX発見を通じても利用可能です。コロナウイルスプロテアーゼの結果は、COVID-19に対する薬物に開発することができる新しい化合物を提案するのに役立ちました。
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