Biochemistry
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纳米微分扫描荧光仪，用于在基于碎片的铅发现中筛选
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Summary May 16th, 2021
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监测目标蛋白（即热移位检测、TSA）融化温度的变化是筛选几百种化合物片段库的有效方法。我们提出了一个TSA协议，实施机器人辅助纳米微分扫描荧光仪（nano-DSF），用于监测内在色氨酸荧光和光反散射，用于碎片筛选。
Transcript
此协议可用于零碎的基数铅发现活动，作为选择有前途的片段作为热候选的附加工具。用于片段筛选的 Nano DSO 使用数量有限的无标签蛋白质样本，可用于几乎所有蛋白质靶点。此方法可用于筛选任何配体集合。
或验证来自其他方法的热量。从零下20或零下80摄氏度的冰柜中取出一块碎板，让它在室温下解冻，在长凳顶部摇床上轻轻摇晃。将板以 500 倍 G 离心 30 秒，收集粘在井边的任何水滴。
使用多通道移液器将MC 2井结晶板和15微升蛋白质库存溶液的移液器放入每个子井中。要检查蚊子身上的碎片和蛋白质板定义，请打开纳米分配器，确保移动组件周围没有障碍物。打开图形用户界面，单击"设置"选项卡，在"甲板配置"下检查提供化合物的板的类型和传输蛋白质的板材是否已经出现在可用板列表中。
如果没有，请单击"选项"，然后"板"，通过填写属性类型的正确值创建新的板定义。在设置选项卡下，指定甲板配置下的板位置。使用下拉菜单，选择 Grainier U 底板作为位置 1 和 MRC 2 井板用于第二位置并保存协议。
将碎片板放在第一位置，蛋白质板放在甲板的第二位置。在协议选项卡中，单击"文件"并选择前一步中保存的用于分配片段的协议。将要分配的碎片的体积定义为 0.3 微升。
对于列 1 和 12 的典型板，不包含片段，定义开始位置到列 2，将结束位置定义为列 11。在某些板中，如果列 2 或 11 是空的，则使用列 3 和 10 作为开始和结束值。单击"运行"以启动程序。
配药后，大约需要两分钟完成，从机器人中取出蛋白质和碎片板，并用胶粘膜密封它们。在 500 倍 G 下短暂离心蛋白质板 30 秒，以收集粘在井两侧的任何滴水，然后再进入下一步。目视检查蛋白质板的井是否有因添加片段而可能发生的降水。
如果在许多油井中观察到降水，则降低碎片的浓度并重复实验。打开普罗米修斯仪器。在触摸屏上，按开抽屉以访问仪器的毛细丝加载模块。
从装载模块中取出磁条，用乙醇清洁镜子以去除任何灰尘颗粒。要将溶液从蛋白质片段板转移到毛细血管，将蛋白质板和毛细血管放在仪器旁边，以便轻松进入毛细血管加载模块。将一个毛细细圈抱在一端，触摸蛋白质板中的溶液与毛细细丝的另一端转移样品。
始终戴手套，确保不要触摸中间的毛细细发，因为手套中的杂质会影响测量。将毛细圈放在支架的指定位置，确保毛细丝正确对齐和居中，重复这些步骤以填充装载模块中的所有位置。最后，将磁条放在毛细血管顶部，将其放在原位，并按紧抽屉启动 Nano-DSF 实验。
打开普罗米修斯应用程序公关。通过单击"开始新会话"来控制并创建新项目。首先，进行发现扫描以检测样品的荧光。通过调整激光的激发功率来改变样品的荧光信号。
对于热变性，请单击熔化扫描选项卡，将起始温度设置为 20 摄氏度，将最终温度设置为 95 摄氏度，将温度坡度设置为每分钟 1 摄氏度。然后单击"开始测量"。此处显示了癌症中一种蛋白质的外、动能或高度表达的移位和熔化温度的频率分布、单极主轴激酶 1 的调节四肽重复域以及 SARS-CoV-2 3c 样蛋白酶。
负值表示在存在碎片时熔化温度降低，而正值表示熔化温度增加。对于 Nsp5，所有片段都有去稳定效果，而对于 Hec1 和 Mps1，观察到稳定和去稳定命中。这是一种廉价且快速的筛选片段库的方法。
其他方法，如NMR或X射线晶体学可以显示碎片的确切结合，他们也可以通过 INX 发现。冠状病毒蛋白酶的结果有助于提出新的化合物，可以开发成药物对抗COVID-19。
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