Biochemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Nanodioxidscanning fluormetri för screening i fragmentbaserad blyupptäckt
Chapters
Summary May 16th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Övervakning av förändringar i smälttemperaturen hos ett målprotein (dvs.termisk skiftanalys, TSA) är en effektiv metod för screening av fragmentbibliotek av några hundra föreningar. Vi presenterar ett TSA-protokoll som implementerar robotassisterad nanodistansskanningsfluormetri (nano-DSF) för övervakning av inneboende tryptofanfluorescens och ljus ryggspridning för fragmentscreening.
Transcript
Det här protokollet är användbart för leadidentifieringskampanjer med fragmenterad bas som ett extra verktyg för att välja lovande fragment som värmekandidater. Nano DSO för fragmentscreening använder en begränsad mängd omärkt proteinprov och kan rutinmässigt användas för nästan alla proteinmål. Denna metod kan användas för att screena alla samlingar av ligands.
eller för att verifiera värme från de andra metoderna. Ta ut en fragmentplatta från minus 20 eller minus 80 grader Celsius frys och låt den tina i rumstemperatur med skonsam skakning på en bänktoppskare. Centrifugera plattan vid 500 gånger G i 30 sekunder för att samla eventuella droppar som fastnar på sidan av brunnarna.
Ta en MRC 2-brunns kristalliseringsplatta och pipett 15 mikroliter av proteinlagerlösningen i varje subbrunn med en flerkanalspipett. För att kontrollera fragment- och proteinplattadefinitioner på Myggan, slå på nanobehållaren och se till att det inte finns några hinder runt de rörliga komponenterna. Öppna det grafiska användargränssnittet, klicka på fliken Inställningar och kontrollera under Däckskonfiguration om vilken typ av platta som föreningarna levereras i och den där proteinet överförs redan finns i listan över tillgängliga plattor.
Om inte klickar du på Alternativ och sedan på Plattor och skapar en ny plåtdefinition genom att fylla i rätt värden för egenskapstypen. Ange plåtpositionerna under Däckskonfigurationen under fliken Inställningar. Använd rullgardinsmenyn och välj Grainier U bottenplatta för position ett och MRC 2-brunnsplatta för position två och spara protokollet.
Placera fragmentplattan på position ett och proteinplattan på plats två på däcket. Klicka på Arkiv på protokollfliken och välj det protokoll som sparats i föregående steg för att dela ut fragmenten. Definiera volymen på de fragment som ska delas ut som 0,3 mikroliter.
För en typisk platta där kolumnerna ett och 12 inte innehåller fragment definierar du startplatsen till kolumn två och slutplatsen till kolumn 11. Om kolumnerna två eller 11 är tomma i vissa plåtar använder du kolumnerna tre och tio som start- och slutvärden. Klicka på Kör för att starta programmet.
Efter dispensering, som tar ungefär två minuter, ta bort proteinet och fragmentplattorna från roboten och försegla dem med en självhäftande tätningsfilm. Centrifugera kort proteinplattan vid 500 gånger G i 30 sekunder för att samla någon droppe som fastnar på sidorna brunnarna innan du fortsätter till nästa steg. Inspektera visuellt proteinplattans brunnar för nederbörd som kan ha inträffat på grund av tillsats av fragmenten.
Om nederbörd observeras i många brunnar, minska koncentrationen av fragmenten och upprepa experimentet. Slå på Prometheus instrumentet. Tryck på Öppna låda på pekskärmen för att komma åt instrumentets kapillärbelastningsmodul.
Ta bort magnetremsan från lastmodulen och rengör spegeln med etanol för att avlägsna eventuella dammpartiklar. För att överföra en lösning från proteinfragmentplattan till kapillärerna, placera proteinplattan och kapillärerna bredvid instrumentet för enkel åtkomst till kapillärbelastningsmodulen. Ta en kapillär som håller den i ena änden och rör lösningen i proteinplattan med den andra änden av kapillären för att överföra provet.
Använd alltid handskar och se till att inte röra kapillären i mitten eftersom föroreningar från handskarna skulle påverka mätningen. Placera kapillären i hållarens avsedda läge och se till att den är korrekt justerad och centrerad, upprepa dessa steg för att fylla alla positioner i lastmodulen. Placera magnetremsan ovanpå kapillärerna i slutet för att hålla dem på plats och tryck på Stäng låda för att starta Nano-DSF-experimentet.
Öppna Prometheus ansökan PR. ThermControl och skapa ett nytt projekt genom att klicka på Starta ny session. Gör först en upptäcktsskanning för att upptäcka proverna. Ändra provexemplars fluorescerande signal genom att justera laserns excitationseffekt.
För en termisk denaturering, klicka på fliken Smältskanning, ställ in starttemperaturen på 20 grader Celsius, sluttemperaturen till 95 grader Celsius och temperaturlutningen till en grad Celsius per minut. Klicka sedan på Startmätning. Frekvensfördelningen av skiftet och smälttemperaturen för yttre, kinetiska eller högt uttryckt i cancer ett protein, reglerande tetratricopeptid upprepa domänen för monopolära spindelkinas 1 och SARS-CoV-2 3c-liknande proteas visas här.
Negativa värden indikerar en minskning av smälttemperaturen i närvaro av ett fragment, medan ett positivt värde indikerar en ökning av smälttemperaturen. För Nsp5 har alla fragment en destabiliseringseffekt, medan både stabiliserande och avstabiliserande träffar observeras för Hec1 och Mps1. Detta är en billig och snabb metod för att screena fragmentbibliotek.
Andra metoder som NMR eller röntgenkristallografi kan visa den exakta bindningen av fragment och de är också tillgängliga genom INX-upptäckt. Resultaten med coronavirus protease hjälpte till att föreslå nya föreningar som kan utvecklas till läkemedel mot COVID-19.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
