Biochemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
פלואורימטריה סריקה ננו-דיפרנציאלית להקרנה בתגלית עופרת מבוססת שבר
Chapters
Summary May 16th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
ניטור שינויים בטמפרטורת ההיתוך של חלבון יעד (כלומר,בדיקת משמרות תרמית, TSA) היא שיטה יעילה לבדיקת ספריות שברים של כמה מאות תרכובות. אנו מציגים פרוטוקול TSA המיישם פלואורימטריה סריקה ננו-דיפרנציאלית בסיוע רובוטיקה (nano-DSF) לניטור פלואורסצנטיות טריפטופן מהותית ופיזור גב אור להקרנת שברים.
Transcript
פרוטוקול זה שימושי עבור קמפיינים לגילוי הפניות מפוצלות ככלי נוסף לבחירת קטעים מבטיחים כמועמדים לחום. Nano DSO להקרנת שברים משתמש בכמות מוגבלת של דגימת חלבון ללא תווית וניתן להשתמש בו באופן שגרתי כמעט לכל מטרות החלבון. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לסנן אוספים של ליגנדים.
או כדי לאמת חום מהשיטות האחרות. מוציאים צלחת שבר ממינוס 20 או מינוס 80 מעלות צלזיוס ומניחים לה להפשיר בטמפרטורת החדר עם רעד עדין על שייקר עליון ספסל. צנטריפוגות את הצלחת ב 500 פעמים G במשך 30 שניות כדי לאסוף את כל טיפות דבק בצד של בארות.
קח צלחת התגבשות MRC 2-היטב ופיפטה 15 מיקרוליטרים של תמיסה מלאי חלבון לתוך כל תת באר באמצעות pipette רב ערוצי. כדי לבדוק הגדרות שבר וצלחת חלבון על היתוש, להפעיל את מתקן ננו ולוודא כי אין מכשולים סביב הרכיבים הנעים. פתח את ממשק המשתמש הגרפי, לחץ על הכרטיסיה התקנה ותחת תצורת סיפון בדוק אם סוג הצלחת שבה מסופקות התרכובות והצלחת שבה מועבר החלבון כבר נמצאים ברשימת הצלחות הזמינות.
אם לא, לחץ על אפשרויות ולאחר מכן על לוחות וצור הגדרת לוח חדשה על-ידי מילוי הערכים הנכונים עבור סוג המאפיין. תחת הכרטיסיה התקנה, ציין את מיקומי הלוח תחת תצורת הסיפון. באמצעות התפריט הנפתח, בחר צלחת תחתונה Grainier U למיקום אחד ו- MRC צלחת 2-well למיקום שני ולשמור את הפרוטוקול.
מניחים את צלחת השברים בעמדה אחת ואת צלחת החלבון בעמדה 2 של הסיפון. בכרטיסיית הפרוטוקול, לחץ על קובץ ובחר את הפרוטוקול שנשמר בשלב הקודם לחלוקת הקטעים. הגדר את עוצמת הקול של השברים שיש לחלק כ- 0.3 מיקרוליטרים.
עבור לוח טיפוסי שבו עמודות 1 ו- 12, אינן מכילות קטעים, הגדר את מיקום ההתחלה לעמודה 2 ואת מיקום הסיום לעמודה 11. בלוחות מסוימים, אם עמודות 2 או 11 ריקות, השתמש בעמודות שלוש ו- 10 כערכי התחלה וסיום. לחץ על הפעל כדי להפעיל את התוכנית.
לאחר חלוקה, אשר לוקח בערך שתי דקות הושלמה, להסיר את החלבון ואת לוחות שבר מהרובוט ולאטום אותם עם סרט איטום דבק. צנטריפוגות בקצרה צלחת החלבון ב 500 פעמים G במשך 30 שניות כדי לאסוף כל טיפה דבק בצדדים הבארות לפני שתמשיך לשלב הבא. בדוק חזותית את בארות צלחת החלבון למשפכים שאולי התרחשו עקב הוספת השברים.
אם משקעים נצפים בארות רבות, להפחית את הריכוז של שברים ולחזור על הניסוי. תדליק את מכשיר הפרומתאוס. במסך המגע, הקש פתח מגירה כדי לגשת למודול הטעינה הנימי של המכשיר.
הסר את הפס המגנטי ממודול הטעינה ונקה את המראה עם אתנול כדי להסיר את כל חלקיקי אבק. כדי להעביר פתרון מצלחת שברי החלבון לנומים, הנח את צלחת החלבון ואת הנימים ליד המכשיר לגישה נוחה למודול הטעינה הנימי. קח נימי אחד מחזיק אותו בקצה אחד ולגעת בתמיסה בצלחת החלבון עם הקצה השני של הנימי כדי להעביר את המדגם.
תמיד ללבוש כפפות ולהקפיד לא לגעת נימי באמצע כמו זיהומים מן הכפפות ישפיעו על המדידה. מקם את נימי בעמדה המיועדת של המחזיק, לוודא שהוא מיושר כראוי ומרוכז, חזור על שלבים אלה כדי למלא את כל המיקומים במודול הטעינה. בסוף, מניחים את הפס המגנטי על גבי הנימים כדי להחזיק אותם במקום ולחץ על סגור מגירה כדי להתחיל את הניסוי Nano-DSF.
פתח את יחסי הציבור של יישום פרומתאוס. ThermControl וליצור פרויקט חדש על ידי לחיצה על התחל הפעלה חדשה. ראשית, בצע סריקת גילוי כדי לזהות את הפלואורסצנטיות של הדגימות. לשנות את האות הפלואורסצנטי של הדגימות על ידי התאמת כוח העירור של הלייזר.
לקבלת denaturation תרמית, לחץ על הכרטיסייה סריקת התכה, להגדיר את טמפרטורת ההתחלה ל 20 מעלות צלזיוס, טמפרטורת הקצה ל 95 מעלות צלזיוס ואת שיפוע הטמפרטורה למעלה אחת צלזיוס לדקה. לאחר מכן לחץ על התחל מדידה. התפלגות תדרים של שינוי וטמפרטורת ההיתוך עבור החיצוני, קינטי, או בא לידי ביטוי גבוה בסרטן חלבון אחד, רגולציה tetratricopeptide לחזור תחום של ציר מונופולרי קינאז 1, ו SARS-CoV-2 3c דמוי פרוטאז מוצגים כאן.
ערכים שליליים מצביעים על ירידה בטמפרטורת ההיתוך בנוכחות קטע, בעוד ערך חיובי מצביע על עלייה בטמפרטורת ההיתוך. עבור Nsp5, לכל השברים יש השפעה דה-ייצוב, ואילו עבור Hec1 ו- Mps1, הן פגיעות ייצוב והן דה-ייצוב נצפים. זוהי שיטה זולה ומהירה לסנן ספריות קטעים.
שיטות אחרות כגון NMR או קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן יכולות להראות את הכריכה המדויקת של שברים והן זמינות גם באמצעות גילוי INX. התוצאות עם פרוטאז קורונה עזרו להציע תרכובות חדשות שניתן לפתח לתרופות נגד COVID-19.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
