Biochemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Nanodifferentiële scanningfluormetrie voor screening in fragmentgebaseerde looddetectie
Chapters
Summary May 16th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Het monitoren van veranderingen in de smelttemperatuur van een doeleiwit(d.w.z.thermische verschuivingstest, TSA) is een efficiënte methode voor het screenen van fragmentbibliotheken van een paar honderd verbindingen. We presenteren een TSA-protocol dat robotica-ondersteunde nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF) implementeert voor het monitoren van intrinsieke tryptofaanfluorescentie en lichtverstrooiing voor fragmentscreening.
Transcript
Dit protocol is nuttig voor lead discovery-campagnes met gefragmenteerde basis als extra hulpmiddel voor het selecteren van veelbelovende fragmenten als warmtekandidaten. Nano DSO voor fragmentscreening maakt gebruik van een beperkte hoeveelheid ongelabeld eiwitmonster en kan routinematig worden gebruikt voor bijna alle eiwitdoelen. Deze methode kan worden gebruikt om alle verzamelingen liganden te screenen.
of om de warmte van de andere methoden te controleren. Haal een fragmentplaatje uit de vriezer van min 20 of min 80 graden Celsius en laat het op kamertemperatuur ontdooien met zacht schudden op een bench top shaker. Centrifugeer de plaat gedurende 30 seconden op 500 keer G om eventuele druppels te verzamelen die aan de zijkant van de putten blijven plakken.
Neem een MRC 2-well kristallisatieplaat en pipetteer 15 microliter van de eiwitvoorraadoplossing in elke subput met behulp van een meerkanaalspipet. Om fragment- en eiwitplaatdefinities op de Mosquito te controleren, schakelt u de nanodispenser in en zorgt u ervoor dat er geen obstakels rond de bewegende componenten zijn. Open de grafische gebruikersinterface, klik op het tabblad Setup en controleer onder Deck Configuration of het type plaat waarin de verbindingen worden geleverd en degene waarin het eiwit wordt overgedragen al aanwezig zijn in de lijst met beschikbare platen.
Als dit niet het jaar is, klikt u op Opties en vervolgens op Platen en maakt u een nieuwe plaatdefinitie door de juiste waarden voor het eigenschapstype in te vullen. Geef op het tabblad Instellingen de plaatposities op onder Deckconfiguratie. Kies in het vervolgkeuzemenu Grainier U-bodemplaat voor positie één en MRC 2-well-plaat voor positie twee en sla het protocol op.
Plaats de fragmentplaat op positie één en de eiwitplaat op positie twee van het dek. Klik op het tabblad Protocol op Bestand en kies het protocol dat in de vorige stap is opgeslagen voor het doseren van de fragmenten. Definieer het volume van de af te geven fragmenten als 0,3 microliter.
Voor een typische plaat waar de kolommen één en 12 geen fragmenten bevatten, definieert u de beginlocatie in kolom twee en de eindlocatie in kolom 11. Als kolom twee of 11 in sommige platen leeg is, gebruikt u de kolommen drie en 10 als begin- en eindwaarden. Klik op Uitvoeren om het programma te starten.
Nadat het doseren, dat ongeveer twee minuten duurt, is voltooid, verwijdert u het eiwit en de fragmentplaten van de robot en sluit u ze af met een zelfklevende afdichtingsfilm. Centrifugeer de eiwitplaat kort op 500 keer G gedurende 30 seconden om eventuele druppels te verzamelen die aan de zijkanten van de putten kleven voordat u doorgaat naar de volgende stap. Inspecteer de putten van de eiwitplaat visueel op neerslag die mogelijk is opgetreden als gevolg van de toevoeging van de fragmenten.
Als neerslag in veel putten wordt waargenomen, verminder dan de concentratie van de fragmenten en herhaal het experiment. Schakel het Prometheus-instrument in. Druk op het aanraakscherm op Lade openen om toegang te krijgen tot de capillaire laadmodule van het instrument.
Verwijder de magneetstrip van de laadmodule en reinig de spiegel met ethanol om eventuele stofdeeltjes te verwijderen. Om een oplossing van de eiwitfragmentenplaat naar de haarvaten over te brengen, plaatst u de eiwitplaat en de haarvaten naast het instrument voor gemakkelijke toegang tot de capillaire laadmodule. Neem een capillair dat het aan het ene uiteinde vasthoudt en raak de oplossing in de eiwitplaat aan met het andere uiteinde van het capillair om het monster over te brengen.
Draag altijd handschoenen en zorg ervoor dat u het capillair in het midden niet aanraakt, omdat onzuiverheden van de handschoenen de meting zouden beïnvloeden. Plaats het capillair in de aangewezen positie van de houder, zorg ervoor dat het goed is uitgelijnd en gecentreerd, herhaal deze stappen om alle posities in de laadmodule in te vullen. Plaats aan het einde de magneetstrip bovenop de haarvaten om ze op hun plaats te houden en druk op Close Drawer om het Nano-DSF-experiment te starten.
Open de Prometheus applicatie PR. ThermControl en maak een nieuw project aan door op Start Nieuwe sessie te klikken. Voer eerst een ontdekkingsscan uit om de fluorescentie van de monsters te detecteren. Wijzig het fluorescerende signaal van de monsters door het excitatievermogen van de laser aan te passen.
Voor een thermische denaturatie klikt u op het tabblad Smeltscan, stelt u de starttemperatuur in op 20 graden Celsius, de eindtemperatuur op 95 graden Celsius en de temperatuur op één graad Celsius per minuut. Klik vervolgens op Meting starten. Frequentieverdeling van de verschuiving en smelttemperatuur voor de buitenste, kinetische of sterk uitgedrukte in kanker één eiwit, regulerend tetratricopeptide herhalingsdomein van het monopolaire spindelkinase 1 en SARS-CoV-2 3c-achtig protease worden hier getoond.
Negatieve waarden duiden op een verlaging van de smelttemperatuur in aanwezigheid van een fragment, terwijl een positieve waarde een toename van de smelttemperatuur aangeeft. Voor Nsp5 hebben alle fragmenten een destabiliserend effect, terwijl voor Hec1 en Mps1 zowel stabiliserende als destabiliserende treffers worden waargenomen. Dit is een goedkope en snelle methode om fragmentbibliotheken te screenen.
Andere methoden zoals NMR of röntgenkristallografie kunnen de exacte binding van fragmenten laten zien en ze zijn ook beschikbaar via INX-ontdekking. De resultaten met coronaprotease hielpen bij het voorstellen van nieuwe verbindingen die kunnen worden ontwikkeld tot geneesmiddelen tegen COVID-19.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
