Immunology and Infection
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使用类似人类单细胞的THP-1白血病细胞系，将巨噬细胞分化和极化成M2样表型
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Summary August 2nd, 2021
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M2样肿瘤相关巨噬细胞（TAM）与肿瘤进展和癌症预后不佳有关。本协议作为在 14 天内可重复区分和分化 THP-1 单细胞状细胞成 M2 样巨噬细胞的详细指南。该模型是研究TAM在肿瘤微环境内的抗炎作用的基础。
Transcript
抗炎肿瘤相关的巨噬细胞与癌症的进展和预后差有关。此协议是一个指南，在 14 天内将 THP-1 单细胞状细胞分化并分化为 M2 样巨噬细胞。目前没有既定的抗炎THP-1极化模型。
此协议使用足够的休息时间和长时间的极化过程来创建独特的 M2 样巨噬体亚型。肿瘤发育，例如结肠癌和组织重塑，由抗炎巨噬细胞控制。在研究其功能的研究中，标准化地创建独特的 M2 样亚型可确保可重复的发现。
首先设置一个定时器 150 秒。将含有THP-1细胞线的冷冻小瓶从液氮中取出，在37摄氏度的清洁水浴中立即解冻小瓶，小瓶一放入水浴中，立即启动定时器。松开盖以释放解冻过程中积聚的压力，确保管打开不接触水以避免污染。
解冻细胞悬架，直到小瓶内留下约四毫米大小的冰片，并立即进入下一步。将细胞悬浮液的液相转移到含有9毫升温暖生长介质的15毫升管中。然后将一毫升的这种温暖的中等细胞悬浮到THP-1小瓶中，然后回到15毫升管中融化剩余的冰片，并冲洗小瓶，以确保没有留下任何细胞。
用一毫升移液器上下轻柔地混合悬架。取出样品的大约10微升，以计数使用试穿蓝色生存能力的细胞。具有透明细胞质的细胞是可行的，蓝色细胞质表示细胞死亡。
在计数时，在 37 摄氏度下以 200 倍 G 的速度旋转暖细胞悬浮 7 分钟。完全去除超高细胞，在生长介质中重新使用细胞，实现每毫升50万细胞的细胞密度。轻轻混合悬架，将 22 毫升转移到 T75 细胞培养瓶中。
将烧瓶直立存放在37摄氏度的孵化器中，二氧化碳浓度为5%，每三到四天更换一次生长介质。准备细胞悬浮，以每口30万毫升的密度将细胞播种到24井细胞培养板中。轻轻混合介质，在50毫升管中加入26毫升的预制液位。
将一毫升的含细胞介质转移到24井板的每个井中。通过在传输之间上下管道轻轻混合媒体。将 PMA 新制的工作解决方案保留在冰上，每口井加入 100 毫克 PMA。
在孵化器中孵育板，无需再治疗72小时。72 小时后，取出生长介质，代之以一毫升新鲜生长介质，确保不用移液器尖触摸井底。让细胞在孵化器中再休息96小时。
取出生长介质，代之以一毫升新鲜生长介质。每口井加入20毫克的间柳金4和20毫克的间柳金13。然后让细胞在孵化器中休息48小时。
48 小时后重复整个过程，让细胞在孵化器中再休息 48 小时。取出生长介质，代之以一毫升新鲜生长介质。然后让细胞在孵化器中休息48小时。
从每口井中取出温细胞介质，代之以一毫升冰冷PBS混合物，不含钙镁和5%FBS。然后立即将细胞板放在冰上45分钟。在冰上45分钟后，用迷你细胞刮刀刮掉细胞。
在冰上保存的 15 毫升管中，轻轻将分离的巨噬细胞转移到冰冷的 PBS 和 5% FBS 中。两极分化法产生的巨噬细胞显示了CD14的表达，以及CD11b标记。单细胞和大噬细胞标记CD14和CD11b分别表示在70.9%和74.7%。细胞。
在0.2%的细胞中，细胞显示M1样标记CD80的表面水平较低，62.6%的细胞显示M2样标记CD206的表面水平较低。由于中等温度的 THP-1 细胞倾向于沉入小瓶底部，并且容易通过机械应力激活，因此对细胞进行温和的混合和处理非常重要。M2 样巨噬细胞可重复创建，并且使用 QR-TPCR、ELISA 和流细胞学进行特征。
这是研究癌症发展或组织重塑中的抗炎机制的基础。
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