Chemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Scambio idrogeno/deuterio basato sull'elettroforesi capillare per la caratterizzazione conformazionale di proteine con spettrometria di massa top-down
Chapters
Summary June 8th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Qui viene presentato un protocollo per un approccio di scambio idrogeno/deuterio (HDX) basato sull'elettroforesi capillare accoppiato con la spettrometria di massa top-down. Questo approccio caratterizza la differenza nelle strutture di ordine superiore tra diverse specie proteiche, comprese le proteine in diversi stati e diverse proteoforme, conducendo simultaneamente HDX differenziale e separazione elettroforetica.
Transcript
Questo metodo consente di separare le specie proteiche coesistenti, inclusi diversi conformatori o varianti e di completare online le loro differenze di struttura di ordine superiore in un'unica misurazione CEMS. Utilizza l'effetto elettroforetico per fornire un ambiente di durata quasi del 100% per le reazioni HDX e la separazione ortogonale delle specie proteiche coesistenti durante l'HDX per l'analisi della SM dall'alto verso il basso. Inizia con il precondizionamento dell'elettroforesi capillare, dello scambio di idrogeno deuterio o della configurazione CE HDX.
Utilizzando l'ultrasonicazione in una miscela di 50% metanolo, 49% acqua e 1% acido formico, pulire il flusso attraverso l'interfaccia microviale CE-MS per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Montare il capillare modificato HPC sull'elettroferesi capillare o sullo strumento CE. Risciacquare il capillare con soluzione di elettrolita di fondo o BGE per 10 minuti utilizzando il campionatore automatico e lasciarlo riempire con il BGE.
Utilizzare una lunghezza appropriata di tubo capillare di silice fusa non modificato come tubo di infusione per la soluzione modificatrice. Utilizzare un'unione e un manicotto appropriato per collegare il tubo modificatore a una siringa di vetro a tenuta di gas con una temperatura smussata e risciacquare il tubo con la soluzione modificatore per almeno 10 minuti utilizzando una pompa per infusione. Inserire le uscite del capillare e del tubo modificatore CE codificato HPC caricato con le soluzioni corrispondenti nell'interfaccia CE-MS pulita.
Far avanzare la siringa con le pompe per infusione in modo che la soluzione modificatrice raggiunga la punta dell'interfaccia. Montare l'interfaccia CE-MS assemblata su una sorgente di ionizzazione a spruzzo nanoelettronico che ospita uno spettrometro di massa. Applicare una tensione di spruzzatura di 3-5 kilovolt all'interfaccia CE-MS.
Infondere la soluzione modificatrice con la pompa infusore a una portata compresa tra 0,1-10 microlitri al minuto e garantire un elettrospruzzatore stabile sulla punta dell'interfaccia CE-MS. Posizionare il flaconcino del campione contenente il BGE e il campionatore automatico, che verrà utilizzato in seguito per acquisire elettroferogrammi vuoti e spettri di massa in bianco. Stimare il volume di iniezione utilizzando la relazione tra volume di iniezione e parametri di iniezione.
E iniettare la soluzione campione utilizzando il campionatore automatico a due PSI per una durata appropriata. Avviare la separazione CE applicando una tensione elettroforetica di 20 kilovolt in una pressione di infusione compresa tra 0-2 PSI e acquisire l'elettroferogramma. Nel frattempo, acquisire i dati MS in modalità cromatografica in cui il grafico a corrente ionica viene acquisito in funzione del tempo e le corrispondenti scansioni MS non vengono automaticamente combinate in un unico spettro.
Salvate l'elettroferogramma vuoto e gli spettri di massa come riferimenti. Posizionare i flaconcini campione contenenti le concentrazioni desiderate delle soluzioni campione proteiche nell'autocampionatore e acquisire gli elettroferogrammi e gli spettri MS1 delle specie proteiche elettroforeticamente separate ed etichettate con deuterio. Eseguire misurazioni in tandem Ms.per le specie di interesse, dopo aver acquisito gli spettri MS1 all'interno della stessa corsa o in una successiva corsa separata.
Dopo ogni misurazione, lavare il capillare con BGE ad una pressione di 20 PSI per almeno 10 minuti. Pulire l'interfaccia CEMS e tutti i tubi per lo stoccaggio al termine degli esperimenti. Acquisire un set di dati del campione di endpoint HDX con SM in modalità infusione diretta.
Una bassa pressione di infusione ha portato a una migliore separazione dei picchi CE, ma ha portato ad un aumento sia del tempo di migrazione che della durata dell'esperimento. Un tempo di reazione HDX più lungo ha comportato un livello più elevato di dedurazione degli analiti proteici. La varianza A e B delle beta immunoglobuline o beta IG, che differiscono solo per due residui di amminoacidi nella loro sequenza, ha dato origine a due picchi adeguatamente separati nell'elettroferogramma derivato dall'EIC.
La varianza differenziale marcata con deuterio ha portato a una distribuzione di massa distinta degli ioni. Un numero inferiore in abbondanza relativa di ioni Z rispetto agli ioni C è stato osservato a causa dell'unico legame disofiato nella conferma di beta IG che limita l'efficienza di frammentazione tra CS 82 e CS 176. La maggior parte degli ioni frammento prodotti da beta IGA e beta IGB mostrano un'estensione simile di assorbimento del deuterio.
Tuttavia, i segmenti più grandi che coprono i siti di variazione della sequenza da beta IGA sono stati dedurati in misura significativamente maggiore rispetto al beta IGB. Il pH di BGE viene regolato in base al punto isoelettrico del campione per prevenire l'aggregazione proteica e facilitare la separazione mantenendo il complesso.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
