Chemistry
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Troca de hidrogênio/deutério à base de eletroforose capilar para caracterização conformacional de proteínas com espectrometria de massa de cima para baixo
Chapters
Summary June 8th, 2021
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Apresentado aqui é um protocolo para uma abordagem de troca de hidrogênio/deutério à base de eletroforese capilar (HDX), juntamente com espectrometria de massa de cima para baixo. Essa abordagem caracteriza a diferença nas estruturas de alta ordem entre diferentes espécies proteicas, incluindo proteínas em diferentes estados e diferentes proteoformes, conduzindo o diferencial simultâneo HDX e a separação eletroforética.
Transcript
Este método permite que a separação de espécies proteicas coexistindo, incluindo diferentes conformadores ou variantes e caracterização on-line de suas diferenças de estrutura de ordem superior a serem concluídas em uma única medição cems. Ele utiliza o efeito eletroforético para fornecer um ambiente de quase 100% de duração para as reações HDX e separação ortogonal das espécies de proteína coexistindo durante o HDX para análise de MS de cima para baixo. Comece com o pré-condicionamento da eletroforese capilar, troca de deutério de hidrogênio ou configuração DE HDX CE.
Usando ultrassônica em uma mistura de 50% de metanol, 49% de água e 1% de ácido fórmico, limpe o fluxo através da interface microvial CE-MS por pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente. Monte o capilar modificado HPC na eletroferese capilar ou instrumento CE. Enxágüe o capilar com solução de eletrólito de fundo ou BGE por 10 minutos usando o amostrador automático e deixe-o preenchido com o BGE.
Use um comprimento apropriado de tubo capilar de sílica fundido não modificado como tubo de infusão para a solução modificador. Use uma manga de união e adequada para conectar a tubulação do modificador a uma seringa de vidro apertada a gás com uma temperatura sem cortes e enxágue a tubulação com a solução de modificador por pelo menos 10 minutos usando uma bomba de infusão. Insira as saídas do tubo capilar e modificador CE codificado por HPC carregados com as soluções correspondentes na interface CE-MS limpa.
Avance a seringa com as bombas de infusão de tal forma que a solução modificador atinja a ponta da interface. Monte a interface CE-MS montada em uma carcaça de fonte de ionização de spray de nano elétron de um espectrômetro de massa. Aplique uma tensão de pulverização de 3-5 quilovolts na interface CE-MS.
Infundir a solução do modificador com a bomba infusora a uma taxa de fluxo que varia de 0,1-10 microliters por minuto e garantir um spray eletro estável na ponta da interface CE-MS. Coloque o frasco de amostra contendo o BGE e o amostrador automático, que será usado posteriormente para adquirir eletroferogramas em branco e espectros de massa em branco. Estime o volume de injeção usando a relação entre o volume de injeção e os parâmetros de injeção.
E injete a solução amostral usando o amostrador automático em dois PSI por uma duração apropriada. Inicie a separação ce aplicando uma tensão eletroforética de 20 quilovolts em uma pressão de infusão que varia de 0-2 PSI e adquira o eletroferograma. Enquanto isso, adquira os dados de MS no modo cromatógrafo onde o gráfico atual de íon é adquirido em função do tempo e as varreduras de MS correspondentes não são automaticamente combinadas em um único espectro.
Salve o eletroferograma em branco e o espectro de massa como referências. Coloque os frascos de amostra contendo as concentrações desejadas das soluções de amostragem de proteínas no amostrador automático e adquira os eletroferógramas e espectros MS1 das espécies de proteínas eletroforeticamente separadas e deutério. Realize as medições tandem Ms.para as espécies de interesse, seja após a aquisição do espectro MS1 dentro da mesma corrida ou em uma corrida separada subsequente.
Após cada medição, lave o capilar com bge a uma pressão de 20 PSI por pelo menos 10 minutos. Limpe a interface CEMS e todos os tubos para armazenamento após a conclusão dos experimentos. Adquira um conjunto de dados da amostra de ponto final HDX com MS no modo de infusão direta.
Uma baixa pressão de infusão resultou em uma melhor separação dos picos de CE, mas levou a um aumento tanto no tempo de migração quanto na duração do experimento. Um tempo de reação mais longo do HDX resultou em um maior nível de desduração dos analitos proteicos. A variância A e B da imunoglobulina beta ou beta IG, que diferem por apenas dois resíduos de aminoácidos em sua sequência, deram origem a dois picos adequadamente separados no eletroferógrafo derivado do EIC.
A variância diferenciada rotulada de deutério resultou em uma distribuição em massa distinta de íons. Observou-se menor número em abundância relativa de íons Z do que os íons C devido à ligação disofiada única na confirmação do IG beta que limita a eficiência de fragmentação entre CS 82 e CS 176. A maioria dos íons fragmentados produzidos a partir de Beta IGA, e beta IGB exibem uma extensão semelhante de absorção de deutério.
No entanto, os segmentos maiores que cobrem os sites de variação de sequência do IGA beta foram dedurados em uma extensão significativamente maior do que o Beta IGB. O pH do BGE é ajustado de acordo com o ponto isoelétrico da amostra para evitar a agregação de proteínas e facilitar a separação, mantendo o complexo.
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