Developmental Biology
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तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं में यांत्रिक संकेतों का अध्ययन करने के लिए एक अनुकूलित O9-1/हाइड्रोजेल सिस्टम
Chapters
Summary August 13th, 2021
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विस्तृत कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल यहां बहुपेंट O9-1 तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं और अलग कठोरता के पॉलीएक्रीलैमाइड हाइड्रोगेल का उपयोग करके विट्रो में यांत्रिक संकेतों का अध्ययन करने के लिए वर्णित हैं।
Transcript
विधि तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं के यांत्रिक संकेत और रासायनिक संकेतों के साथ इसकी बातचीत के अध्ययन में एड्स । यह रोगों में तंत्रिका शिखा विकास के आणविक और आनुवंशिक तंत्र में भी सहायता कर सकता है। ग्लास कवर स्लिप को स्थानांतरित करना सबसे चुनौतीपूर्ण है इसलिए उन्हें तोड़ने और छोड़ने से रोकने के लिए धीरे-धीरे और ध्यान से स्थानांतरित करें।
प्रक्रिया का प्रदर्शन मुझे और डॉ शेरी Zhao, मेरी प्रयोगशाला से एक पोस्टडॉक्टोरल फेलो होगा । प्रयोगशाला पोंछ के एक टुकड़े पर कांच कवर फिसल जाता है की वांछित संख्या रखकर शुरू करते हैं। फिर शराब बर्नर की लौ के माध्यम से इसे आगे और पीछे से गुजर कर प्रत्येक कवर स्लिप को निष्फल करें।
जब कवर ठंडा हो जाता है, तो लगभग 200 माइक्रोलीटर और 25 मिलीमीटर कवर स्लिप के साथ 0.1 मोलर सोडियम हाइड्रोक्साइड के 800 माइक्रोलीटर के साथ 12 मिलीमीटर कवर स्लिप को कवर करें। पांच मिनट के बाद, सोडियम हाइड्रोक्साइड को एस्पिरेट करें और कवर स्लिप को पांच मिनट के लिए सूखी हवा में जाने दें ताकि एक भी फिल्म बनाई जा सके । एक बार कवर स्लिप सूख जाने के बाद, 12 मिलीमीटर कवर स्लिप पर अमीनोप्रोपिल ट्राइएथॉक्सीलेन या एपीटीएस के लगभग 18 माइक्रोलीटर और 25 मिलीमीटर कवर स्लिप पर एपीटीएस के 150 माइक्रोलीटर जोड़ें।
अवशिष्ट एपीटीएस को पांच मिनट तक सूखने की अनुमति देने के लिए एक्सेस एपीटीएस का उपयोग करें। बाद में, कवर स्लिप को हर बार पांच मिनट के लिए बाँझ डिएक्रिल पानी में जलमग्न करके तीन बार कुल्ला करें। धोया कवर स्लिप को प्रतिक्रियाशील पक्ष के साथ एक ताजा पेट्री डिश में ले जाएं।
और 30 मिनट के लिए पर्याप्त 0.5% ग्लूटारल्डिहाइड में भिगोकर कवर स्लिप का इलाज करें। ग्लूटारल्डिहाइड को एस्पिराल्ड के बाद, कवर स्लिप को तीन मिनट के लिए डियोनाइज्ड पानी के साथ कुल्ला करें और हवा में प्रतिक्रियाशील पक्ष के साथ कवर स्लिप सूखी हो। सिलिकॉन कवर स्लिप तैयार करने के लिए, कवर स्लिप की बराबर संख्या रखें क्योंकि पैरा फिल्म के साथ लाइन में लगी पेट्री डिश में अमीनोसिलेन कोटेड कवर स्लिप होती है।
इसके बाद 12 मिलीमीटर कवर स्लिप को 40 माइक्रोलीटर के साथ और 25 मिलीमीटर कवर स्लिप को 150 माइक्रोलीटर डाइक्लोरोमेथेन सिलेन या डीसीएमएस के साथ पांच मिनट तक ट्रीट करें। एक मिनट के लिए एक बार बाँझ deionized पानी के साथ कवर स्लिप धोने से पहले प्रतिक्रियाशील कवर पर्चियों रखने से पहले एक प्रयोगशाला पोंछ पर चेहरा । हाइड्रोगेल्स तैयार करने के लिए, सूखे अमीनोसिलेन कोटेड कवर स्लिप पर पिपेट ने ताजा तैयार एक्रिलामाइड जेल समाधान किया।
घुमावदार चिमटी का उपयोग करके, तुरंत जेल समाधान के शीर्ष पर डीसीएमएस इलाज कवर स्लिप को स्थानांतरित करें, जिसमें जेल समाधान को छूने वाले पक्ष के साथ इस प्रकार सैंडविचिंग दो कवर स्लिप के बीच जेल समाधान को बदल देता है। एक बार जेल बहुलक होने के बाद, घुमावदार चिमटी के साथ डीसीएमएस इलाज कवर स्लिप को अलग करें, जिससे अमीनोसिलेन कोटेड कवर स्लिप से जुड़े जेल को छोड़ दिया जाए। इसके बाद, एक पूर्व निर्धारित 4-अच्छी तरह से या 24-अच्छी तरह से बाँझ PBS या deionized पानी के ५०० माइक्रोलीटर के साथ कवर प्लेट में संलग्न हाइड्रोजेल के साथ 12 मिलीमीटर कवर पर्ची जलमग्न और एक 6 अच्छी तरह से बाँझ PBS या 30 मिनट के लिए deionized पानी के दो मिलीलीटर के साथ कवर प्लेट में 25 मिलीमीटर कवर पर्ची ।
अतिरिक्त एक्रिलैमाइड समाधान को हटाने के बाद, हाइड्रोगेल्स को बाँझ पीबीएस या कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए पानी को डिवोनाइज्ड स्टोर करें। बाद में, जेल को पूरी तरह से कवर करने के लिए सल्फो-सक्सिनीमिडिल या सल्फो-सनपा समाधान जोड़ने से पहले पीबीएस या कुएं की प्लेट से पानी को अपमानित करें। और 15 वाट के तहत समाधान के साथ जैल रखें, 365 नैनोमीटर पराबैंगनी प्रकाश 10 मिनट के लिए खुला।
प्लेट को झुकाकर जितना संभव हो सके प्रति घोल सल्फो-सैंपाएच का जितना हिस्सा इकट्ठा करें। और फिर 15 मिलीमोलर एचईपी के साथ दो से तीन बार जेल धोएं। हाइड्रोगेल युक्त प्रत्येक कुएं में 0.2% एसिटिक एसिड में पतला मिलीलीटर कोलेजन 1 प्रति मिलीलीटर 1 जोड़ें।
और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर रात भर जैल इनक्यूबेट । अगले दिन, 37 सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर 10% घोड़े सीरम और 5% एफबीएस वाले पीबीएस के साथ हाइड्रोगेल्स को इनक्यूबेट करने से पहले पांडुलिपि में वर्णित वॉश करें। दो घंटे की इनक्यूबेशन के बाद, 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ बाँझ फ़िल्टर किए गए डीएमईएम के 500 माइक्रोलीटर को प्रत्येक कुएं में जोड़ें और जैल को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर स्टोर करें।
जब सेल संस्कृति तैयार होती है, तो लगभग 1.5 गुना 10 से चौथे 09-1 कोशिकाओं को बाज़ेल माध्यम में चुकता किया जाता है। प्लेट पर सीधे उगाई जाने वाली कोशिकाओं से झूठे संकेतों को कम करने के लिए कवर स्लिप को एक नई प्लेट में परिवहन करने के लिए चिमटी का उपयोग करें। फिर, कमरे के तापमान पर 0.1% ट्राइटन एक्स-100 के 500 माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं के इलाज से पहले 10 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 500 माइक्रोलीटर का उपयोग करके कोशिकाओं को ठीक करें।
15 मिनट के बाद, 10% गधे सीरम के 250 माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं को चलें। 10% गधे सीरम के 250 माइक्रोलीटर में 1 से 400 के कमजोर पड़ने पर फेलोडिपाइन के साथ एफ-ऐक्टिन के लिए कोशिकाओं को दाग दें, इसके बाद 10 मिनट के लिए DAPI के साथ इनक्यूबेशन। प्रत्येक अच्छी तरह से बढ़ते माध्यम की तीन से चार बूंदें जोड़ने से पहले दो मिनट के लिए पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं ।
फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर, व्यक्तिगत और विलय चैनलों का उत्पादन करने वाले हाइड्रोगेल नमूने के अनुसार कम से कम तीन यादृच्छिक फ्रेम की छवियों को कैप्चर करें। परमाणु बल माइक्रोस्कोपी या एएफएम के माध्यम से हाइड्रोजेल के कठोरता आकलन में, बल वक्र की ढलान नरम हाइड्रोगेल के लिए कोमल थी क्योंकि एएफएम जांच से आवश्यक बल कम था। हालांकि, कड़े हाइड्रोगेल पर, उत्पन्न ढलान बहुत अधिक था।
एएफएम माप का उपयोग किलोपास्कल में युवा के लोचदार मॉड्यूल से हाइड्रोगेल्स की औसत कठोरता की गणना करने के लिए किया जाता था। पी 19 और 09-1 कोशिकाओं की विकास विशेषताओं को एक किलोपास्कल और 40 किलोपास्कल हाइड्रोगेल में नियंत्रण और संशोधित जेल प्रणालियों में देखा गया। मूल जेल प्रणालियों पर उगाई जाने वाली 09-1 कोशिकाओं के परिणामस्वरूप मृत कोशिकाओं की संख्या अधिक होती है।
इसके विपरीत संशोधित जेल प्रणालियों पर उगाई जाने वाली 09-1 कोशिकाओं ने स्वस्थ कोशिका विकास और हाइड्रोगेल के लिए पर्याप्त लगाव को न्यूनतम गोल कोशिकाओं द्वारा इंगित छोटे सेल डेक के साथ सब्सट्रेट किया। दोनों हाइड्रोजेल सिस्टम पर चढ़ाया P19 कोशिकाओं दौर अस्थाई कोशिकाओं की एक अतिरिक्त और सेल सब्सट्रेट अनुलग्नकों की कमी प्रदर्शित की । संशोधित हाइड्रोजेल प्रणाली के साथ तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं या एनसीसी की अनुकूलता का आकलन एपी-2 के लिए इम्यूनोफ्लोरेटेंट स्टेनिंग द्वारा किया गया था।
संशोधित हाइड्रोगेल प्रणाली पर चढ़ाया 09-1 कोशिकाओं में एपी-2 अभिव्यक्ति में एक महत्वपूर्ण वृद्धि देखी गई । इसके अतिरिक्त, 09-1 कोशिकाओं ने तनाव फाइबर की अलग-अलग मात्रा के माध्यम से कम या उच्च कठोरता हाइड्रोगेल के आधार पर विभिन्न मॉर्फोलोजी का प्रदर्शन किया। 40 किलोपाल हाइड्रोगेल पर उगाई जाने वाली 09-1 कोशिकाओं में एंटी-विनक्यूलिन अभिव्यक्ति एक किलोपास्कल हाइड्रोगेल पर उगाए गए लोगों की तुलना में अधिक थी जो यह दर्शाती है कि नरम सब्सट्रेट्स पर उगाई जाने वाली कोशिकाएं कठोर सब्सट्रेट की तुलना में न्यूनतम फोकल इसके अलावा परिसर बनाती हैं।
हाइड्रोगेल के बहुलीकरण के लिए उपयुक्त प्रतीक्षा समय महत्वपूर्ण है क्योंकि एक्रिलैमाइड कोशिकाओं के लिए जहरीले होते हैं। बेहतर परिणाम सुनिश्चित करने के लिए पीबीएस या डिपोनाइज्ड पानी में हाइड्रोगेल को कम से कम 30 मिनट के लिए जलमग्न करें।
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