שחזור פעילות החילוץ Msp1 עם רכיבים מטוהרים לחלוטין

השימוש ב-AAA-ATPases להסרת חלבונים משכבת שומנים הוא נושא נפוץ בבקרת איכות החלבון. הבנה מכנית של תהליך חיוני זה דורשת מערכת מחודשת. שחזורים קודמים עם AAA-ATPases היו מורכבים והטרוגניים.

המערכת שלנו פשוטה ומוגדרת במלואה. זה מאפשר לנו לתפעל את AAA-ATPase Msp1, את המצע ואת סביבת השומנים. כדי להתחיל, להוסיף חוצץ שיקום שהוכן בעבר, חלבוני Msp1 ו- TA מטוהרים וליפוזומים בצינור PCR, ולאחר מכן לדגור את התערובת על קרח במשך 10 דקות.

במהלך הדגירה, חותכים את הקצה של קצה פיפטה P200 לקוטר של כ -1/8 אינץ ‘. לאחר מכן, מערבולת הצינור המכיל BioBeads ביסודיות כדי לקבל תערובת אחידה. לאחר מכן, הסר במהירות את המכסה והשתמש בקצה פיפטה P200 לחתוך כדי להעביר נפח מתאים של החרוזים לצינור PCR ריק.

לאחר הדגירה של 10 דקות לשחזור הושלמה, באמצעות קצה פיפטה לא מלוטש, להסיר את כל הנוזל מן BioBeads. לאחר מכן, להעביר 100 microliters של השיקום לתוך הצינור עם BioBeads ולאפשר לו לסובב על גלגל במשך 16 שעות. למחרת, לסובב את הצינור PicoFuge כדי גלולה החרוזים, ולאחר מכן להעביר את החומר reconstituted לצינור PCR נקי ולשמור את הצינור על קרח.

להסרת חלבונים שלא הצליחו לשחזר לתוך ליפוזומים, ישיבב את עמודי ספין גלוטתיון עם חוצץ החילוץ, אשר בדרך כלל כרוך שלושה סיבובים של כביסה עם 400 microliters של חוצץ, ואחריו צנטריפוגה כדי להסיר את המאגר. לאחר מכן, הוסף חמישה מיקרומולים של כל מלווה לחומר המחודש, ואחריו 100 מיקרוליטרים של חיץ החילוץ, מה שמביא את הנפח עד 200 מיקרוליטרים. הוסף תערובת זו לעמודות ספין גלוטתיון המשודרגות, ולאחר מכן חבר את עמודות הסיבוב וסובב אותן במשך 30 דקות, ומאפשר למלווים להיקשר לשרף.

לאחר הסיבוב, סובב את העמודות בקצרה. לאסוף את הזרימה דרך, שהוא החומר פינה מראש מרוקן של חלבונים מצטברים. מניחים אותו על קרח וממשיכים ישירות לבחיסת החילוץ.

הכן צינורות לניתוח SDS-PAGE. הוסף 45 מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים לצינור הכניסה, 40 מיקרוליטרים של מים לצינור הזרימה, ו-16.6 מיקרוליטרים של חיץ טעינה 4X SDS-PAGE לכל צינור. לבדיקת החילוץ, הכינו את תגובת החילוץ והעלו את הנפח הסופי ל-200 מיקרוליטרים עם חיץ החילוץ.

לאחר מכן, לפני המלחמה את ההסתה החילוץ בבלוק חום 30 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. כדי ליזום את ההסתה, להוסיף ATP לריכוז סופי של שני מילימולים. לסובב את הצינור במשך חמש שניות PicoFuge, ולדגירה אותו ב 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.

במהלך הדגירה, לקחת דגימת מיקרוליטר חמש של התגובה ולהוסיף אותו צינור הקלט. כמו כן, שיווי משקל עמודת ספין גלוטתיון אחת עבור כל דגימה בבדיקת החילוץ כפי שהודגם בעבר. לאחר הדגירה של 30 דקות הושלמה, להוסיף 200 microliters של חוצץ החילוץ לצינור, להביא את הנפח הכולל ל 400 microliters.

לאחר מכן, הוסף תגובה זו לשרף גלוטתיון המשוויב ואפשר לו להסתובב במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב, לסובב את העמודות כדי לאסוף את הזרימה דרך, ולאחר מכן לקחת מדגם 10 microliter עבור צינור הזרימה דרך. לשטוף את השרף פעמיים עם 400 microliters של חוצץ החילוץ, להשליך את הזרימה דרך לאחר כל לשטוף.

לאחר הכביסה השלישית, לשמור על הזרימה דרך ולקחת מדגם 50 microliter עבור צינור לשטוף. לאחר מכן, להכין חמישה מיליליטר של חוצץ elution על ידי הוספת גלוטתיון מופחת לריכוז הסופי של חמישה מילימולים במאגר החילוץ. הוסף 200 מיקרוליטרים של מאגר ההרחבה לעמודת הספין ודגר במשך חמש דקות.

לאחר מכן, צנטריפוגה העמוד ולאסוף את הזרימה דרך. חזור על שלב ההתחמקות פעם נוספת. לאחר ההשתלטות השנייה, קחו 50 מיקרוליטר אליקוט מדגם ההחמצה והוסיפו אותו לצינור האלגנטי.

לאחר הפעלת כתם מערבי, יעילות החילוץ יכולה להיקבע על ידי השוואת כמות המצע בשבר האלגנטי עם שבר הקלט. האות בזרימה מראה שונות מסוימת, אך הוא בדרך כלל דומה לשבר הקלט, ואין אות בשבר הכביסה. בדרך כלל, יש יעילות חילוץ כ 10% עבור השליטה החיובית ויעילות החילוץ של אחד עד 2% עבור השליטה השלילית.

כאשר תנאי השיקום אינם ממוטבים, רמות החילוץ דומות בין הדגימות החיוביות והשליליות. טכניקה זו אפשרה למעבדה שלנו לבדוק תכונות ביופיסיות של המצע להשפיע על זיהוי על ידי Msp1.