Live-Cell Imaging af transskriptionel aktivitet på DNA Double-Strand Pauser

Denne protokol gør det muligt at observere og opdage transskription begivenheder og giver indsigt om virkningerne af DNA dobbelt-streng pauser på den igangværende transskription af et gen. Den største fordel ved teknikken er observation af individuelt mærkede RNA udskrifter i enkelte celler med tidsintervaller på sekunder over en samlet periode på en time eller mere. Denne metode giver indsigt i DNA-skadesresponsen for at undersøge krydstale mellem transskription og cellulære processer, såsom DNA-replikation og DNA-læsioner.

Vores råd er at observere celler ved hjælp af doxycyclin og at udføre kalibreringsmålinger for at træne påvisningsstedet og mærket RNA-molekyler. I et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør fremstilles opløsning A indeholdende 150 mikroliter af reduceret serum MEM plasma DNA og 2,5 mikrogram pr. mikroliter DNA i transfection helper reagens. Samtidig fremstilles opløsning B, der indeholder 150 mikroliter af reduceret serum MEM og 1,5 mikrogram pr. mikroliter DNA i et lipidbaseret transfectionreage.

Inkuber begge opløsninger ved stuetemperatur i fem minutter, tilsæt derefter forsigtigt opløsning A til løsning B og inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur. For at transfect cellerne, tilsæt 300 mikroliter af blandet opløsning A og B dropwise til hver skål og forsigtigt distribuere det. Opbevar glasbundsskålen inde i en 100 millimeter standard cellekulturskål og inkuber den ved 37 grader Celsius i en befugtet atmosfære med 5% kuldioxid.

Forbered 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør med 200 mikroliter af DMEM med HEPES uden phenol rød og suppleret med 10% trækul-strippet føtalt kvæg serum, derefter tilføje TA. Ca. en time før du starter mikroskopi observation, fremkalde transskription af reporter gener ved at tilføje doxycyclin til vækstmediet og forsigtigt blandes ved pipetting op og ned med en 200 mikroliter mikropipette. Transport cellerne til mikroskopet mindst 30 minutter før observationen påbegyndes, og læg 100 millimeter skålen med cellerne inde i det forvarmede store mikroskopinkubationskammer. Placer mikrocentrifugerøret med den for fortyndede TA inde i det store mikroskopmiljøkammer for at opvarme det til 37 grader Celsius.

Udskift låget på glasbundsfadet med et låg, der har et boret hul i diameter på tre millimeter. Vælg 100X olie nedsænkning mål i mikroskop kontrolpanelet og anvende en dråbe nedsænkning olie til målet. Indstil glasbundsskålen med cellerne inde i mikroskopstadiets inkubationskammer og lås det på plads, og luk derefter låget på sceneinkubatoren og alle døre i mikroskophuset.

Start mikroskopets drifts- og styringssoftware, åbn fokuskontrolvinduet, og klik på områderuden. Klik på 100 % øjeboksen i emissionsvalgsruden for at indstille den okulære strålesti til direkte prøveobservation med øjet. Skift til øjenfiltersæt i menuen filtersæt, og klik på Brightfield, og tryk derefter på den åbne Brightfield-knap.

Flyt mikroskopmålet mod glasbundsskålen, indtil olien rører glasset. Kig gennem okulæren og manuelt fokusere på flyet af cellerne, derefter slukke den åbne Brightfield knap. Lad cellerne stå i 30 minutter, før de eksperimentelle observationer påbegyndes, så de kan tilpasse sig miljøforholdene og forhindre brændpunktsdrift under billeddannelse på grund af temperaturgradienter.

Opsætning af en 200 mikroliter mikropipette og 200 microliter filterspidser ved stuetemperatur. I mikroskopstyringssoftwarens fokuskontrolvindue skal du indstille laserintensiteten til 5 % og angive en værdi på 50 millisekunder for eksponeringstiden. Åbn hentningsvinduet for at justere indstillingerne for at udføre en automatisk billedopsamling af tredimensionelle timelapser.

Vælg 3D-hentningsopsamlingstypen, og angiv 12 til 16 optiske skiver adskilt af 0,4 mikrometer. Markér afkrydsningsfelterne for området omkring strøm, og vend tilbage til den aktuelle position efter hentning. Angiv en værdi på 120 for antallet af tidspunkter og 30 sekunder for intervallet i timelapse-hentningsruden.

Vælg det konfokalyske filtersæt i henhold til de transekterede fluorescerende proteinetiketter som nævnt i tekstmanuskriptet, og angiv eksponeringstiden for hver kanal til 50 millisekunder. Brug indstillingsstrømmen for lasereffekten til at bruge værdien 5 %, der er valgt i fokusvinduet. Gå til kameraruden i fokuskontrolvinduet, vælg kontrolelementet skalerbilledevisning, og vælg den manuelle knap for at konfigurere et fast interval af billedintensiteter, der skal vises.

Vælg cellerne til 3D timelapse billeddannelse af transskription steder ved induktion af en DNA dobbelt-streng pause. Screen cellerne, og marker tre synsfelter i overensstemmelse med de betingelser, der er beskrevet i diskussionen af teksten. Fokuser hver markeret celle, der tidligere var placeret i midten af synsfeltet, med transskriptionsstedet i det midterste plan i Z-stakken.

Markér hver XYZ-placering i XY-plan i fokuskontrolvinduet ved at klikke på et sætpunkt. Tilføj 200 mikroliter af den for fortyndede TA til cellerne og start 3D-tidsseriebillederne ved at klikke på start på capturevinduet. Gem billeddataene i mikroskopstyringssoftwaredataformatet på mikroskopets styrecomputerhardmdrev.

Tilføj 0,5 mikrogram per milliliter doxycyclin til vækstmediet af cellerne en time før du starter mikroskopi billede erhvervelse. Monter glasbundsskålen inde i mikroskopstadiets inkubationkammer, og forbered billedopsamlingen som tidligere demonstreret. Brug de samme laserintensitets- og eksponeringsindstillinger som før.

Indstil hentningsindstillinger for 2D-tidsserier, og indstil 120 tidsintervaller med intervaller på 500 millisekunder i timelapse-capturepanelet. Erhverve snesevis af kalibrering tidsserier fra flere positioner for at generere datasæt til at tælle flere hundrede enkelt udskrift TFI målinger. Ved hjælp af denne protokol opnås en graf, der viser antallet af fluorescerende mærkede reportergenudskrifter over tid med en tidsmæssig opløsning på sekunder over perioder på op til timer.

Tiden for TFI værdier af en PROM reporter gen transskription site mærket af ophobning af MS2 pels protein mærket med de grønne fluorescerende proteinmolekyler på spirende udskrifter er vist her. Induktionen af en enkelt DSB i reportergener gør det muligt at undersøge dens indvirkning på den igangværende reportergentransskription og overvågningen af transskriptioner, der kommer fra DSB-grunden, nemlig brud-induceret transskription. TA-tilføjelse og induktion af en DSB fører til en undertrykkelse af PROM reporter gentransskription efter ca. 11 minutter, der ikke genoprettes før 60 minutter.

Den fuldstændige inddrivelse af PP7-RFP-signalet viser break-induceret transskription indledning. Exon 2 antisense reporter genet viser promotor-drevne transskriptioner opsigelse, som derefter erstattes af antisense break-induceret transskription som afsløret af ophobning af MS2 pels protein mærket med en rød fluorescerende protein bindende til RNA genereret fra antisense MS2 stilk loop sekvenser. Valg af celler til billeddannelse, oprette behandlet timelapse imaging justere Z position af mærket transskription site på hver XY position i midten af Z stakken, der skal erhverves.

Og endelig skal tilføjelsen af TA fortyndet i vækstmedium udføres med ekstrem omhu for at forhindre eventuelle skift af de prævalgte positioner med celler, der skal afbildes. Billeddannelsen af enkelt RNA udskrifter i 3D over tid i levende celler kan anvendes til at studere RNA transskription under DNA-replikation eller ændringer af transskription under cellecyklus progression.