Gecombineerde mechanische en enzymatische dissociatie van hippocampusweefsel van muizenhersenen

Het succesvol dissociëren van kleine hoeveelheden neuraal weefsel kan laboratoria uitrusten om structuurspecifiek inzicht te krijgen in de werkzaamheid van de behandeling, cellulaire functie, evenals ziekte en behandelingsmechanismen van actie. Dit neurale dissociatieprotocol levert consequent een zeer levensvatbare en werkelijke eencellige suspensie op. Bovendien kunnen we monsters verwerken die slechts een fractie zijn van die waarvoor de commerciële kits bedoeld zijn.

Een goede planning en voorbereiding zijn de sleutel tot een succesvol resultaat voor deze techniek. Het zou nuttig zijn om verschillende oefenrondes te lopen om vertrouwd te raken met het protocol. Na het verdoven van een zes maanden oude vrouwelijke C57BL / 6J-muis, knijp je in de onderbuik en til je de huid op met een tang.

Knip vervolgens met een schaar door de vacht en de huid naar de onderkant van de ribbenkast. Maak twee diagonale incisies die beginnen onder de ribbenkast en naar elke schouder bewegen. Reseceer vervolgens voorzichtig het middenrif en de ribbenkast om het hart bloot te leggen.

Nadat u voorzichtig bindweefsel rond het hart hebt verwijderd, gebruikt u een schaar om het rechteratrium te knippen. Schakel vervolgens de isofluraanstroom naar de ontluchter uit. Houd het hart stabiel met een tang en met de schuine kant van de vlindernaald naar boven gericht, doorboort u de linker ventrikel terwijl u de naald waterpas en parallel aan het dier houdt.

Houd vervolgens de naald op zijn plaats, zet de pomp aan en perfuseer ten minste 30 milliliter van de zoutoplossing of heparine-oplossing totdat de vloeistof die het hart verlaat ondoorzichtig is en de lever en longen verbleken van kleur. Schakel na de perfusie de pomp uit, verwijder de naald en breng de muis over naar het dissectiegebied. Snijd na onthoofding de vacht van de achterkant van het hoofd tot aan de ogen en pel de huid terug om de schedel bloot te leggen.

Knip vervolgens de schedel tussen de ogen en maak twee sneden aan de achterkant van de schedel op posities van 10 en 2 uur. Maak vervolgens een lange snede langs de midsagittale lijn van de schedel naar de oorspronkelijke snede tussen de ogen. Pel vervolgens met een tang de twee helften van de schedel weg naar de zijkanten.

Gebruik vervolgens een spatel om de hersenen te verwijderen en plaats deze in een 60 millimeter glazen petrischaal gevuld met koude DPBS en bewaard op ijs. Gebruik een scalpel of scheermes, scheid elke hemisfeer en verwijder de olfactorische bollen en het cerebellum. Verwijder vervolgens de middenhersenen totdat de hippocampus is blootgesteld.

Beveilig vervolgens de hersenen met een tang. Gebruik vervolgens een tweede set tangen en plaag de hippocampus voorzichtig uit elke hemisfeer. Breng beide hippocampi over op een gelabelde buis van 1,5 milliliter met koude DPBS en plaats de buis op ijs.

Breng met een tang de stukjes hippocampiweefsel over naar een C-buis en voeg 30 microliter enzymmengsel 2 toe aan de buis. Na het draaien van de dop en het aandraaien totdat deze klikt, plaatst u de buis in een dissociator en voert u het juiste programma uit. Terwijl het programma loopt, bevochtigt u een celzeef van 70 micron die op een conische buis van 50 milliliter met twee milliliter BSA-buffer wordt geplaatst.

Nadat het dissociatieprogramma is voltooid, voegt u vier milliliter BSA-buffer toe aan het gedissocieerde weefsel en filtert u het mengsel door de celzeef op de conische buis van 50 milliliter. Voeg vervolgens 10 milliliter DPBS toe aan de C-buis. Sluit vervolgens de buis, draai de oplossing voorzichtig en filter deze door de celzeef op de conische buis van 50 milliliter.

Centrifugeer de gefilterde celsuspensie, gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren en sla de pellet op. Voor het verwijderen van puin, resuspend de pellet met 1.550 microliter koude DPBS en breng de suspensie over naar een gelabelde conische buis van 50 milliliter. Voeg vervolgens 450 microliter oplossing voor het verwijderen van koud vuil toe en pipetteer op en neer.

Leg de celsuspensie voorzichtig over elkaar met één milliliter koude DPBS, waarbij de punt tegen de wand van de conische buis blijft. Herhaal de procedure totdat de totale overlay twee milliliter is. Centrifugeer vervolgens de suspensie op 3.000 keer G gedurende 10 minuten met volledige versnelling en volledige pauze.

Zuig de bovenste laag op en veeg vervolgens de pipetpunt heen en weer om de witte middelste laag op te zuigen. Verwijder zoveel mogelijk van de middelste laag zonder de onderste laag te storen. Voeg vervolgens twee milliliter koude DPBS toe en pipetteer op en neer om te mengen.

Centrifugeer vervolgens de suspensie op 1.000 keer G gedurende 10 minuten met volledige versnelling en volledige pauze. Gooi na het centrifugeren het supernatant weg en resuspend de pellet in één milliliter BSA-buffer. Centrifugeer na het tellen van de cellen de resterende celsuspensie en resuspend de pellet in 50 microliter verdunde levende dode vlek.

Breng het monster vervolgens over in een gelabelde stroombuis en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 8 tot 10 minuten in het donker. Voeg na de incubatie 500 microliter BSA-buffer toe en herhaal de centrifugatiestap. Gooi vervolgens het supernatant weg en laat een kleine hoeveelheid buffer in de buis achter.

De primaire poort sloot puin uit in de voorwaartse verstrooiing versus zijverstrooiingspercelen en de dode cellen werden vervolgens uitgesloten. De tweede poort sloot cellen uit die positief waren voor myeline basiseiwit. En van de resterende cellen werden dichtheidsdiagrammen van cellen gemaakt die positief waren voor elk fluorochroom.

De frequentie van elke neuronale celpopulatie werd berekend vanuit de derde poort. Monsters verwerkt met handmatige mechanische dissociatie en enzymatische spijsvertering leverden een aanzienlijk lagere populatie van cellen van belang op, terwijl zowel verse als vaste monsters verwerkt met geautomatiseerde mechanische dissociatie en enzymatische spijsvertering een veelvoudig hogere populatie van cellen van belang vertoonden. Hoewel de stappen voor het verwijderen van perfusie en puin in eerste instantie een uitdaging kunnen zijn, kan het handhaven van een soepele en vaste hand helpen succes te garanderen.