Måling av oksygenforbruk i akutte striatale skiver fra voksne mus

Vi utviklet en ny metode ved hjelp av en XF-analysator for sjøhest for å måle oksygenforbruket direkte. Men vanlig proxy for mitokondriell funksjon i akutt lysbildeskive fra voksne mus. Denne metoden måler en cellulær av energetikk i punkteringer fra anatomisk definerte hjernestrukturer.

Ved å bruke akutte skiver etterligner man det fysiologiske cellemiljøet som ikke kan oppnås på måter isolerte mitokondrielle eller kulturceller. Denne metoden vil være av bred interesse for forskere som arbeider innen Parkinsons sykdom og Huntingtons sykdom. For å begynne, åpne det ekstracellulære fluksanalysesettet og fjern både sensorpatronen og verktøyplaten.

Plasser deretter sensorkassetten til side og ikke berør sensorene. Deretter legger du til 600 mikroliter kalibreringsløsning til hver vegg på bruksplaten. Plasser sensorpatronen på toppen av utstyrsplaten og senk sensorene i kalibreringsløsningen, slik at det trekantede hakket på verktøy- og sensorpatronplaten er riktig justert.

Deretter forsegler du det ekstracellulære fluksanalysesettet med tetningsfilm for å forhindre fordampning av kalibreringsløsningen og plasserer den deretter i en 37 grader Celsius inkubator som ikke er supplert med karbondioksid eller oksygen, over natten. Åpne maljen fange mikroplate og ta ut eyelet plate for vev sitter. Varm deretter et passende volum av pre-oksygenert modifisert kunstig cerebral spinalvæskebuffer til 37 grader Celsius i et 50 milliliter rør.

Deretter legger du BSA til en endelig konsentrasjon på fire milligram per milliliter for å forberede respirasjonsbufferen. Tilsett 625 mikroliter respirasjonsbuffer til hver brønn på maljeplaten forsiktig, samtidig som du unngår å riste platen, slik at ingen luftbobler er tilstede i bufferen til hver brønn. Umiddelbart dissekere hjernen i 10 milliliter iskald pre-oksygenert skjæreløsning.

Deretter bruker du en vibratomseksjon koronale striatale skiver, etter produsentens instruksjon med en tykkelse på 150 mikrometer i iskald pre-oksygenert skjæreløsning. Deretter gjenoppretter skivene i 50 ml oksygenert kunstig cerebral spinalvæske. Og hold dem i oppløsning i opptil 30 minutter ved romtemperatur.

Etter utvinning, overfør skivene til en 35 x 10 millimeter petriskål med fem millimeter respirasjonsbuffer. Ved hjelp av en biopsi i rustfritt stål skape et sirkulært stykke vev i ønsket område av den skivede hjernen ved forsiktig å trykke ned stansen mens du holder skiven i bufferen. Fjern deretter resten av vevet, løft stansen bort og fjern det sirkulære stykket vev inn i bufferen.

Deretter kutter du enden av en milliliter pipettespiss for å lage et hull med en ettpunkts fem til topunkts null millimeter diameter og bruk den til å holde og overføre den stansede skiven til toppen av fangstskjermen. Sug ett stykke stanset hjernevev og legg vevet forsiktig på maskesiden av fangstskjermen, et sirkulært stykke plast med nettet festet til den ene siden. Bruk et papirlommetørk forsiktig fangstskjermen og fjern fuktigheten, noe som gjør at vevet blir klebrig og festet til midten av nettet.

Deretter holder du opptaksskjermen skivesiden ned med pinsett og legger den i en av brønnene på den rugende maljeplaten. Inkuber deretter maljeplaten ved 37 grader Celsius i en inkubator i minst 30 minutter for å tillate temperatur og pH-likevekt før du kjører analysen. Fortynn de ønskede forbindelsene og modifisert kunstig cerebral spinalvæske uten BSA til den endelige lagerkonsentrasjonen av arbeidskonsentrasjonen for henholdsvis port A til D.

Last forsiktig 75 mikroliter av de fortynnede forbindelsene inn i de passende injeksjonsportene på sensorpatronen ved å plassere spissene halvveis inn i injeksjonsportene i en 45 graders vinkel med spissen mot veggen på injeksjonsporten, da fullstendig innsetting kan forårsake sammensatt lekkasje gjennom porten. Etterpå trekker du spissene forsiktig ut av portene uten å skape luftbobler, og du må ikke banke på noen del av sylinderampullen for å unngå å lindre luftbobler. Inspiser deretter injeksjonsportene visuelt for jevn lasting, slik at all væske er i porten og at det ikke er resterende dråper på toppen av sylinderampullen.

Etter å ha plassert sensorpatronen på bruksplaten, sett den inn i en inkubator i 30 minutter for å la den varme opp til 37 grader Celsius mens den håndteres forsiktig ved bare å holde på verktøyplaten og bevege seg så lite som mulig. Last først analysemalen i programvaren, og trykk deretter på den grønne startknappen. Legg deretter sensorpatronen på utstyrsplaten i instrumentbrettet, slik at platen sitter riktig og er flat, og legg den legemiddelfylte sensorkassetten inn i analysatoren for kalibrering.

Følg deretter instruksjonene på skjermen for å kalibrere. Og balansere sensorene. Når likevektstrinnet er fullført, fjern kalibreringsplaten og erstatt den med maljeplaten som inneholder maske- og vevskivene.

Mål deretter oksygenforbruket i hver brønn på platen, ved hjelp av analyseprotokollene som beskrevet i manuskriptet. Deretter analyserer du måledataene for oksygenforbrukshastighet og koblingseffektivitetsdataene. Oksygenforbruk for ulike tykkelser og hullstørrelser på skiver i kontrollgruppen viste stabil basal respirasjon over hele målingen og var proporsjonal med volumet på skiven.

Videre var oksygenforbruket relativt stabilt i fem timer med mindre enn 10% nedkjøring. Mitokondriell koblingseffektivitet ble sammenlignet, og skiven på 150 mikrometer tykkelse og en 1,5 millimeter slagstørrelse viste den høyeste koblingseffektiviteten. Oksygenforbruket ble målt for unge og gamle grupper av Pink1 knockout og deres aldersmatchede villtypemus.

Det basale oksygenforbruket var likt i både knockout- og villtypegruppene for unge mus. Men det gikk ned for knockoutmusene i den gamle gruppen. Imidlertid ble mitokondriell dysfunksjon i knockoutmusene observert for den unge aldersgruppen, indikert av den reduserte koblingseffektiviteten forårsaket av knockout av Pink1.

De kritiske trinnene i denne protokollen inkluderer å forberede hjerneskiver, overføre dem til toppen av fangstskjermen, plassere lysbilder i brønner og holde dem festet til fangstskjermen under målingene.