Summary
Oksygenforbruk (OCR) er en vanlig proxy for mitokondriell funksjon og kan brukes til å studere ulike sykdomsmodeller. Vi utviklet en ny metode ved hjelp av en Seahorse XF analysator for å direkte måle OCR i akutte striatale skiver fra voksne mus som er mer fysiologisk relevant enn andre metoder.
Abstract
Mitokondrier spiller en viktig rolle i cellulær ATP-produksjon, reaktiv oksygenartregulering og Ca2+ konsentrasjonskontroll. Mitokondriell dysfunksjon har vært involvert i patogenesen av flere nevrodegenerative sykdommer, inkludert Parkinsons sykdom (PD), Huntingtons sykdom og Alzheimers sykdom. For å studere rollen til mitokondrier i modeller av disse sykdommene, kan vi måle mitokondriell respirasjon via oksygenforbruk (OCR) som en proxy for mitokondriell funksjon. OCR har allerede blitt målt i cellekulturer, så vel som isolerte mitokondrier. Disse teknikkene er imidlertid mindre fysiologisk relevante enn å måle OCR i akutte hjerneskiver. For å overvinne denne begrensningen utviklet forfatterne en ny metode ved hjelp av en Seahorse XF-analysator for å måle OCR direkte i akutte striatale skiver fra voksne mus. Teknikken er optimalisert med fokus på striatum, et hjerneområde involvert i PD og Huntingtons sykdom. Analysatoren utfører en levende celleanalyse ved hjelp av en 24-brønns plate, som tillater samtidig kinetisk måling av 24 prøver. Metoden bruker sirkulære stansede biter av striatale hjerneskiver som prøver. Vi demonstrerer effektiviteten av denne teknikken ved å identifisere en lavere basal OCR i striatale skiver av en musemodell av PD. Denne metoden vil være av bred interesse for forskere som arbeider innen PD og Huntingtons sykdom.
Introduction
Mitokondriell dysfunksjon har vært involvert i flere nevrologiske sykdommer, inkludert Parkinsons sykdom (PD), Huntingtons sykdom og Alzheimers sykdom 1,2,3. PD-modeller som PINK1 knockout (KO) mus og rotter viser nedsatt mitokondriell funksjon 4,5,6,7,8,9,10,11. Mitokondrier isolert fra striatum (STR) eller hele hjernen til alderen PINK1 KO mus viser defekter i kompleks I 7,10,12,13. Direkte måling av oksygenforbrukshastigheten (OCR) er en av de vanligste metodene for å evaluere mitokondriell funksjon siden OCR er kombinert med ATP-produksjon, hovedfunksjonen til mitokondrier14. Derfor kan måling av OCR i sykdomsmodeller eller pasientavledede prøver / vev bidra til å undersøke hvordan mitokondriell dysfunksjon fører til sykdom.
For tiden er det flere måter å måle mitokondriell OCR på, inkludert Clark-elektroden og andre O 2-elektroder, O2 fluorescerende fargestoff og den ekstracellulære flussanalysatoren 15,16,17,18,19. Som en fordel tillater O2 elektrodebaserte metoder at forskjellige underlag enkelt kan tilsettes. De er imidlertid utilstrekkelige til samtidig å måle flere prøver. Sammenlignet med tradisjonelle O2 elektrodebaserte metoder, tilbyr den ekstracellulære fluksanalysatoren, et vanlig verktøy for OCR i cellekulturer eller rensede mitokondrier, forbedret gjennomstrømning 15,18,20. Likevel brukes alle disse metodene vanligvis til å måle OCR i isolerte mitokondrier eller cellekulturer 6,16,17,19,20,21. Isolering av mitokondrier forårsaker utilsiktet skade, og ekstraherte mitokondrier eller cellekulturer er mindre fysiologisk relevante enn intakte hjerneskiver22. Selv når mikroelektroder brukes i skiver, er de mindre følsomme og vanskeligere å betjene enn i dyrkede celler23.
For å møte disse utfordringene utviklet vi en metode ved hjelp av XF24 ekstracellulær fluksanalysator, som gjør det mulig å analysere flere metabolske parametere fra akutte striatale hjerneskiver av mus24. Denne teknikken gir kontinuerlig direkte kvantifisering av mitokondriell respirasjon via OCR. Kort fortalt plasseres små deler av striatale hjerneskiver i brønner på øyplaten, og analysatoren bruker oksygen- og protonfluorescerende baserte biosensorer for å måle OCR og ekstracellulær forsuringshastighet, henholdsvis 17,21,25.
En av de unike egenskapene til analysatoren er de fire injeksjonsbrønnene, som tillater fortsatt måling av OCR mens sekvensielt injiserer opptil fire forbindelser eller reagenser; Dette muliggjør måling av flere cellulære respirasjonsparametere, for eksempel basal mitokondriell OCR, ATP-bundet OCR og maksimal mitokondriell OCR. Forbindelsene som ble injisert under målingene for protokollen vist her, var arbeidskonsentrasjoner på 10 mM pyruvat i den første løsningsbrønnen (port A), 20 μM oligomycin i den andre løsningsbrønnen (port B), 10 μM karbonylcyanid 4-(trifluormetoksy) fenylhydrazon (FCCP) i den tredje brønnen (port C) og 20 μM antimycin A i den fjerde brønnen (port D), basert på Fried et al.25. Det må bemerkes at disse konsentrasjonene var arbeidskonsentrasjoner, og stamløsninger på henholdsvis 10x, 11x, 12x og 13x ble injisert i løsningsportene A til D. Hensikten med å bruke hver løsning var som følger: 1) Pyruvat var nødvendig siden uten det ville tilsetningen av FCCP ha en redusert OCR-respons forårsaket av en begrensning av tilgjengelige substrater; 2) Oligomycin hemmer ATP-syntase og tillater måling av ATP-koblet respirasjon; 3) FCCP kobler oksidasjon fra fosforylering og tillater måling av maksimal mitokondriell kapasitet; 4) Antimycin A hemmer kompleks III i elektrontransportkjeden og tillater derfor måling av OCR som ikke er knyttet til mitokondriene.
Konsentrasjonen av oligomycin som ble brukt ble bestemt ut fra følgende årsaker: 1) Den anbefalte dosen av oligomycin for de fleste celletyper (isolerte mitokondrier eller cellekulturer) er 1,5 μM. Av erfaring brukes vanligvis 3x-10x av dissosierte celledosen til skiveeksperimentene, siden det kan være en gradient, og penetrasjonen av løsningen i skivene tar tid. Derfor bør konsentrasjonen ligge i området 5 μM til 25 μM. 2) En konsentrasjon på 20 μM ble valgt basert på Fried et al.25. Høyere konsentrasjoner ble ikke forsøkt på grunn av oligomycins uspesifikke toksisitet. 3) I rapporten fra Underwood et al.26 gjorde forfatterne et titreringseksperiment for oligomycin og fant at doser på 6,25, 12,5, 25 og 50 μg / ml resulterte i lignende inhibering. Den høyere konsentrasjonen av oligomycin (50 μg/ml) hemmet ikke mer, men hadde større varians. 4) I vår observasjon synes den avgjørende faktoren å være oligomycins penetrerende evne. Det er vanskelig for oligomycin å trenge inn i vevet, og det er derfor det tar minst 7 til 8 sykluser for å nå platået, maksimal respons. Så lenge den når platået, antas inhiberingen å være maksimal.
En viktig teknisk utfordring ved å tilpasse den ekstracellulære fluksanalysatoren for måling av OCR i striatale skiver er å forhindre vevshypoksi. Siden bufferen ikke ble oksygenert under hele måleperioden (ca. 4 timer), var hypoksi et sentralt tema. Dette gjelder spesielt for tykkere vevsprøver, der oksygen ikke kan diffundere gjennom prøvene. For å overvinne dette problemet ble skiver seksjonert med en tykkelse på 150 μm, slik at omgivende oksygen kunne trenge inn i midten av hjerneskivene. I tillegg ble 4 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) tilsatt den pre-oksygenerte kunstige cerebrospinalvæskebufferen (ACSF), noe som gjorde det lettere å bestemme maksimal OCR, som tidligere antydet23. Vi undersøkte om cellene var i live. Først ble Hoechst 33258 (10 μM) og propidiumjodid (10 μM) brukt til å undersøke om cellene var sunne under disse forholdene. Vi undersøkte deretter om medium spiny nevroner var funksjonelt sunne ved hjelp av patch-clamp-opptak. Vi vurderte videre om dopaminterminaler (DA) i striatale skiver var funksjonelt sunne ved å måle DA-frigjøring ved hjelp av hurtigskanningsvolammetri. Resultatene viste at striatale skiver som ikke var oksygenert (ACSF/BSA-gruppen) var like friske som den oksygenerte kontrollgruppen24.
Vi testet deretter forskjellige kombinasjoner av skivetykkelse og slagstørrelse for å bestemme optimale striatale skiveforhold for fluksrespirasjonsanalysen. Dorsale striatale skiver med forskjellige tykkelser (150 μm og 200 μm) og stansestørrelser (1,0 mm, 1,5 mm og 2,0 mm i diameter) ble brukt til OCR-analyse ved hjelp av analysatoren. Striatale skiver som var 150 μm tykke med en slagstørrelse på 1,5 mm i diameter hadde den høyeste koblingseffektiviteten og OCR innenfor et optimalt område for analysatoren24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrene, inkludert dyrearbeid, ble utført i henhold til nasjonale og internasjonale retningslinjer og ble godkjent av Animal Care and Use Committee ved Thomas Jefferson University. Mannlige FVB/NTac mus i alderen 3 til 14 måneder ble brukt. Følgende trinn ble utført i en ikke-steril setting, men det bør utvises forsiktighet for å holde alt så rent som mulig.
MERK: Metoden som presenteres her ble etablert og brukt i forskningen rapportert av Zhi et al.24. Eksperimentene beskrevet her brukte en seahorse XF24 ekstracellulær fluksanalysator (se materialtabell). Disse metodene kan tilpasses XFe24-analysatoren, og noen resultater ble bekreftet ved hjelp av denne analysatoren.
1. Hydratpatronsensorer (1 dag før analysen)
- Åpne det ekstracellulære fluksanalysesettet (se materialtabell) og fjern både sensorpatronen (grønn) og bruksplaten (klar; Figur 1A). Plasser sensorkassetten til side (sensorene opp) og ikke berør sensorene.
- Tilsett 600 μL kalibrantoppløsning (pH 7,4) til hver brønn på bruksplaten. Plasser sensorpatronen på toppen av utstyrsplaten og senk sensorene i kalibrantløsningen. Kontroller at det trekantede hakket på verktøyet og sensorkassettplaten er riktig justert (figur 1B).
- Forsegl det ekstracellulære fluksanalysesettet med tetningsfilm for å forhindre fordampning av kalibrantløsningen, og plasser den deretter i en 37 ° C inkubator som ikke er supplert med CO2 eller oksygen over natten.
2. Forbered vevsplaten (på analysedagen)
- Åpne holmefangets mikroplate og ta ut holmeplaten for vevspassing.
- Varm et passende volum (625 μL per brønn) av pre-oksygenert modifisert kunstig cerebrospinalvæske (ACSF, sammensetning 140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,4 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 25 mM glukose, 10 mM HEPES, pH 7,2) buffer til 37 ° C i et 50 ml rør. Deretter tilsettes BSA til en endelig konsentrasjon på 4 mg/ml for å klargjøre respirasjonsbufferen. Generelt er 50 ml nok for en plate.
- Tilsett 625 μL respirasjonsbuffer (pre-oksygenert ACSF-buffer med 25 mM glukose og 4 mg/ml BSA) til hver brønn på holmeplaten forsiktig og unngå å riste platen. Forsikre deg om at det ikke er resterende dråper på toppen av sensorpatronen, og at det ikke er noen luftbobler i bufferen til hver brønn.
3. Akutt tilberedning av striatale skiver og utskåret skiveplassering
- Halshugg musen etter cervikal dislokasjon og disseker hjernen umiddelbart i 10 ml iskald pre-oksygenert skjæreløsning (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 3,7 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 10 mM glukose, pH 7,4).
- Seksjon koronale striatale skiver med vibratom etter produsentens instruksjon (se Materialtabell) med en tykkelse på 150 μm i iskald, pre-oksygenert skjæreløsning.
- Gjenopprett skivene i 50 ml oksygenert ACSF (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,4 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 10 mM glukose, 2 mM HEPES, pH 7,4) og hold oppløsningen i opptil 30 minutter ved romtemperatur (RT).
- Etter gjenvinning, overfør skivene til en 35 mm x 10 mm petriskål med 5 ml respirasjonsbuffer.
- Bruk en biopsistans i rustfritt stål (f.eks. 1,5 mm diameter) for å lage et sirkulært stykke vev i ønsket område av den skivede hjernen. Hold skiven i bufferen mens du trykker forsiktig ned med stansen. Pass på at stansen presses hardt nok ned til å kutte vevet. Fjern resten av vevet, løft stansen bort, og fjern det sirkulære stykket vev inn i bufferen.
- Skjær enden av en 1 ml pipettespiss for å lage et hull med en diameter på 1,5–2,0 mm, og bruk den til å holde og overføre den stansede skiven til toppen av opptaksskjermen. Sug ett stykke stanset hjernevev og plasser vevet forsiktig på maskesiden av fangstskjermen (figur 2A). Opptaksskjermen vil være et sirkulært stykke plast med nettet festet til den ene siden.
MERK: Opptaksskjermene er inkludert i mikroplatepakken (se Materialtabell) og ligner på den som brukes i Schuh et al.23. - Bruk forsiktig et papirlommetørke til å tørke opptaksskjermen en kort stund. Når fuktigheten er fjernet, blir vevet klebrig, noe som gjør at skiven kan feste seg til midten av nettet. Ikke tørk skiven for mye, ellers vil den bli skadet.
- Hold skjermskiven med lav vekt med pinsetten og legg den i en av brønnene på den rugende øyplaten (figur 2B). Vær forsiktig så du ikke slipper skiven; I så fall tar du skjermen ut og legger et nytt stykke på den.
MERK: Ikke plasser hjerneskiver i de to bakgrunnskorreksjonsbrønnene (A1 og D6) i øyplaten. - Inkuber øyplaten ved 37 °C i en inkubator i minst 30 minutter for å tillate temperatur og pH-balanse før analysen kjøres.
4. Lasting av patroner med ønskede forbindelser
- Fortynn de ønskede forbindelsene i modifisert ACSF (37 °C) til den endelige lagerkonsentrasjonen på henholdsvis 10x, 11x, 12x og 13x av arbeidskonsentrasjonen for port A til D, og juster til pH 7,4. Testen vil administrere forbindelsene i rekkefølge fra port A til D. For dette eksperimentet ble følgende løsninger brukt, med deres respektive arbeidskonsentrasjon nevnt før dem: 10 mM pyruvat (port A), 20 μM oligomycin (port B), 10 μM eller andre konsentrasjoner av FCCP (port C) og 20 μM antimycin A (port D).
- Forhåndslast forsiktig 75 μL av de fortynnede forbindelsene i de egnede injeksjonsportene på sensorpatronen. Plasser spissene halvveis inn i injeksjonsportene i 45° vinkel med spissen mot veggen på injeksjonsporten. Spissene må ikke settes helt inn i bunnen av injeksjonsportene, da dette kan føre til lekkasje gjennom porten.
- Trekk spissene forsiktig ut av portene for å unngå å skape luftbobler. Ikke knips på noen del av sylinderampullen for å unngå lindring av luftbobler.
- Inspiser injeksjonsportene visuelt for jevn lasting. Forsikre deg om at all væske er i porten, og at det ikke er noen gjenværende dråper på toppen av kassetten.
- Plasser sensorpatronen på utstyrsplaten og sett den i en inkubator (ikke CO2) i 30 minutter slik at den kan varmes opp til 37 °C igjen. Håndter forsiktig ved å bare holde på utstyrsplaten. Beveg deg så lite som mulig.
5. Kalibrering og utførelse av analysen
- Last inn analysemalen i programvaren. Trykk på den grønne START-knappen .
- Sørg for å laste inn riktig protokoll. Protokollen inneholder en kombinasjon av 3 min blanding, 3 min ventetid og 2 min målesekvenser (disse tre trinnene danner en måling). Endre avstanden til sondehodet fra 26 600 til 27 800 i maskinvareinnstillingene under instrumentinnstillinger25. Det er ikke nødvendig å bytte sondehode for XFe24-analysatoren. Trykk på START.
- Legg sensorkassetten på verktøyplaten i instrumentskuffen. Hakket går foran, venstre hjørne. Forsikre deg om at platen sitter riktig og er flat. Legg den legemiddelfylte sensorkassetten inn i analysatoren for kalibrering.
- Følg instruksjonene på skjermen for å kalibrere og likevekte sensorene. Dette tar rundt 30 min.
- Når kalibreringstrinnet er fullført, fjerner du kalibreringsplaten og erstatter den med øyplaten (som inneholder maske- og vevskivene).
- Mål oksygenforbruket i hver brønn på platen ved hjelp av analyseprotokollene. Protokollen inneholder en kombinasjon av 3 min blanding, 3 min ventetid og 2 min målesekvenser (disse tre trinnene danner en måling), på hvilket tidspunkt OCR beregnes.
- For hele eksperimentet inkluderer du 4x OCR-målinger for å lage en grunnlinje, etterfulgt av injeksjon av port A (pyruvat) med 4x målinger, deretter injeksjon av port B (oligomycin) med 8x målinger, deretter injeksjon av port C (FCCP) med 5x målinger, og til slutt injeksjon av port D (antimycin A) med 6x målinger.
MERK: Dette antallet målinger etter hver sammensatte injeksjon bestemmes avhengig av når målingen når platået. - Analyser OCR-måledataene og koblingseffektivitetsdataene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det første trinnet i denne studien var å optimalisere skivetykkelsen og stansestørrelsen som ble brukt til å fjerne en del av striatum fra skiven (figur 3A). En skive på 150 μm tykkelse og en 1,5 mm slagstørrelse ga de beste resultatene bestemt av koblingseffektiviteten (Figur 3B-C). Som vist i figur 3B, er OCR relativt stabil i 5 timer med mindre enn 10% nedkjøring. I tillegg ble det brukt funksjonelle målinger, samt patch-clamp-registrering av kortikale nevroner og medium spiny nevroner i striatum, og rask skanning syklisk voltammetri (FSCV) måling av DA-frigjøring, for å demonstrere at nevronene og terminalene var fullt funksjonelle i dette preparatet, som vist i Zhi et al.24. Inkludert i dette testet vi deretter forskjellige konsentrasjoner av FCCP for å finne ut hvilke som ville gi best respons; 10 μM FCCP ga den beste avlesningen (figur 3D1,D2) bestemt av den ledige respirasjonskapasiteten:
Ekstra respirasjonskapasitet = maksimal respirasjon - basal respirasjon
Disse skiveforholdene ble brukt til å måle forskjellene i OCR av striatale skiver fra PINK1 KO mus og villtype (WT) kullkamerater. For resultatene av PINK1 KO og WT mus ble 3-4 mus brukt og 4-6 replikasjoner per mus ble brukt og i gjennomsnitt for å oppnå ett datapunkt. Siden PINK1 er en nøkkelregulator for mitokondriell funksjon, var det forventet at mitokondriell dysfunksjon ble funnet hos KO-musene, målt ved redusert mitokondriell OCR. Faktisk var en aldersavhengig reduksjon i OCR tydelig hos KO-musene sammenlignet med deres WT-kontroller (figur 4A, D). Basal OCR var lik i både KO- og WT-gruppene for unge mus (3-4 måneder); Imidlertid reduserte basal OCR for KO-musene i den gamle gruppen (10-14 måneder; Figur 4B,E). Koblingseffektivitet, bestemt som nedenfor,
Koblingseffektivitet = [ATP-produksjonshastighet] / [basal respirasjonshastighet] × 100
imidlertid redusert i KO-musene for både unge og gamle grupper (figur 4C, F). Disse dataene viser at delene av striatalvev fra PINK1 KO-mus hadde mitokondriell dysfunksjon. Denne dysfunksjonen i KO-musene startet også fra ung alder, indikert av redusert koblingseffektivitet, selv om basal OCR bare ble redusert i den gamle gruppen. Denne aldersavhengige reduksjonen var sannsynligvis et resultat av akkumulerende mitokondrielle defekter forårsaket av knockout av PINK1.
Figur 1: Bilder som viser de ekstracellulære fluksanalysatorenes hydratpatronsensorer og plate. (A) Sensorkassetten som sitter oppå en kalibreringsplate (bruksplate). (B) Sidevisning av bruksplaten og sensorpatronplaten. Det trekantede hakket på verktøyet og sensorpatronplaten skal være riktig justert. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Stanset skivefeste og plassering. (A) Stanset skive festes til maskeinnsatsen på opptaksskjermen, og deretter (B) plasseres forsiktig i en av brønnene på den rugende holmeplaten for å sikre at skiven ikke løsner eller beveger seg under målingen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Optimal striatal skivetilstand for fluksrespirasjonsanalyse. (A) Diagram over vevsstansstørrelser (1,0 mm, 1,5 mm og 2,0 mm i diameter) for striatum (STR) med røde sirkler som representerer områdene som ble oppnådd for analysen. (B1) O2 forbruksrater (OCR) for forskjellige tykkelser og stansestørrelser på skiver i kontrollgruppen viste stabil basal respirasjon over hele målingen (4 timer), og OCR var proporsjonal med volumet av skiven. OCR ble målt i 150 μm og 200 μm tykkelse skiver stanset av 1,0 mm, 1,5 mm og 2,0 mm punch. Kombinasjonene som brukes er nevnt i legendene som tykkelse * slagstørrelse (f.eks. 150 μm * 1 mm). (B2) Gjennomsnittlige OCR-er målt i 150 μm tykkelsesskiver stanset med 1,5 mm slag; n = 7. (C1) Representative OCR-responser av skiver i forskjellige tykkelser og diametre med 10 mM pyruvat (P), 20 μM oligomycin (O), 10 μM FCCP (F) og 20 μM antimycin A (A) injisert sekvensielt. Pilene angir tidspunktet for injeksjon av disse forbindelsene. (C2) Mitokondriell koblingseffektivitet ble sammenlignet mellom ulike grupper. Skiver på 150 μm * 1,5 mm hadde høy koblingseffektivitet, men den minste variansen; n = 4. (D1) Titreringseksperiment for FCCP ble utført, og 10 μM FCCP ga størst ledig kapasitet; n = 4 for hver gruppe. (D2) Titreringseksperimenter for FCCP ble utført med en analysator, og 10 μM FCCP ga den største ledige kapasiteten; n = 4 for hver gruppe. Verdiene gitt i figurene er gjennomsnittlige ± standardfeilen i gjennomsnittet (SEM). Dette tallet er modifisert fra Zhi et al.24. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: PINK1 KO skiver fra den gamle gruppen som viser signifikant lavere OCR. OCR av akutte STR-skiver (150 μm * 1,5 mm) fra mus hos unge (A, B og C) og de gamle gruppene (D, E og F), utsatt for suksessive tilsetninger av respiratoriske modulatorer (vist ved hjelp av piler). OCR for den unge gruppen var ikke signifikant forskjellig mellom forskjellige genotyper (B), mens koblingseffektiviteten (bestemt som en prosentverdi ved hjelp av formelen nevnt ovenfor %) ble redusert i PINK1 KO-skiver (C). I den gamle gruppen viste PINK1 KOslices signifikant redusert basal respirasjonsnivå (E) og koblingseffektivitet (F). Følgende oppløsning, 10 mM pyruvat (P), 20 μM oligomycin (O), 10 μM FCCP (F) og 20 μM antimycin A (A), ble injisert sekvensielt. n = 4 for hver genotype og alder. Verdiene gitt i figurene er gjennomsnittlig ± SEM. Forskjellen ble vurdert som signifikant når p < 0,05 (*). Dette tallet er modifisert fra Zhi et al.24. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden vi utviklet tillot en XF-analysator å bli brukt til å måle OCR i striatale skiver fra voksne mus over et tidsrom på 4 timer. Denne metoden gir en ny måte å måle cellulær bioenergetikk i slag skåret ut fra anatomisk definerte hjernestrukturer. Siden vevsprøvene som analyseres er ganske små, kan de metabolske parametrene til bestemte hjerneområder involvert i en sykdom undersøkes. I tillegg etterligner bruk av akutte skiver nærmere det fysiologiske cellulære miljøet, som ikke kan oppnås med isolerte mitokondrier eller dyrkede celler og organotypiske skiver. Videre øker måling av OCR i flere hjernegrupper fra et enkelt dyr eller på tvers av flere dyr i en 24-brønns plate i stor grad den statistiske kraften til studier som implementerer denne nye teknikken.
Dette er den første protokollen for OCR-måling i akutte striatale skiver fra voksne mus. Fokuset var på STR, da det er et av hjerneområdene som hovedsakelig er involvert i PD og Huntingtons sykdom. Basal OCR og koblingseffektivitet i vår studie er sammenlignbare med de andre studiene som måler OCR i akutte hjerneskiver ved hjelp av XF-analysatoren 25,26,27. Imidlertid virker den ledige respiratoriske kapasiteten til striatale skiver i vår studie mindre sammenlignet med de andre rapportene som målte andre hjerneområder. Fortsatt ukjent er om denne forskjellen gjenspeiler sanne forskjeller i ledig respiratorisk kapasitet mellom hjerneområder eller små forskjeller i skivepreparasjon, utskåret skiveplassering eller musestamme. Disse forskjellene berettiger videre undersøkelser.
Det er flere kritiske trinn i denne protokollen, inkludert å forberede akutte hjerneskiver, overføre den stansede skiven til toppen av fangstskjermen og plassere skiven i brønnen. Skivene skal holdes festet til opptaksskjermen under målingen. Ellers, hvis skiven løsner fra skjermen og sitter i brønnen på platen, vil den være langt borte fra oksygensensoren, noe som resulterer i en mye lavere avlesning av OCR og responser på stoffene. Vi anbefaler minst fire replikasjoner (fire utskårne hjerneskiver i samme område) for hver tilstand og ekskluderer resultatene av de frittliggende skivene. OCR bør være proporsjonal med vevsinnhold. Denne studien målte ikke vevsmengde siden hjernen ble skåret i samme tykkelse, og skiven ble stanset med samme puncher. Dermed var vevsmengden konstant, og det var ikke nødvendig å bestemme vevsinnholdet. Det er viktig å bruke en ny puncher for hver plate (24 skiver) for å sikre skarphet og dermed samme mengde vev. I tillegg tar seksjonering, klargjøring av vevsstans og festing av skivene per mus rundt 30 minutter og tar rundt 2 timer totalt for to par mus. Stabiliteten til akutte hjerneskiver er bare god i 7-8 timer etter snitting selv under optimale forhold (vurdert ved hjelp av følsomme funksjonelle analyser-patch-clamp-opptak for å evaluere nevronenes sunne tilstand) og dermed kan det ikke være praktisk å bruke et 96 brønnoppsett.
For å illustrere nytten av teknikken målte vi OCR fra striatale skiver fra PINK1 KO-mus og deres WT-kullkamerater. En signifikant reduksjon ble funnet i basal respirasjon av alderen PINK1 KO mus sammenlignet med aldersmatchede WT-kontroller, i samsvar med aldersavhengige DA-frigjøringsunderskudd24. Denne observasjonen stemmer også overens med tidligere publiserte studier, og bekrefter gyldigheten av denne protokollen. Det er også begrensninger ved metodene. For eksempel ble OCR målt fra den akutte striatale hjerneskiven, som sannsynligvis er hjerneaktivitetsuavhengig og for det meste tilbyr inaktive medium spiny nevroner og dopaminerge terminaler, samt astrocytter. I tillegg har metoden ikke en celletypespesifikk oppløsning.
Oppsummert måler denne nye metoden OCR i akutte hjerneskiver fra voksne mus og demonstrerer hvordan PINK1, et PD-relatert gen, påvirker mitokondriell funksjon hos mus. Denne metoden er enkel å implementere og allment anvendelig for forskere som arbeider innen PD og Huntingtons sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Wangchen Tsering og Pamela Walter for deres kritiske lesning og redigering av dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (NS054773 til CJL og NS098393 til HZ) og Institutt for nevrovitenskap ved Thomas Jefferson University (Startup Funds til HZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumet AB150 pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | 13-636-AB150 | To measure pH |
| Antimycin A from streptomyces sp. | SIGMA | A8674 | To inhibit complex III of the mitochondria |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | A6003 | To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF) |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | SIGMA | C2920 | To uncouple mitochondrial respiration |
| D-Glucose | SIGMA | G8270 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| DMSO | SIGMA | D8418 | To dissovle compounds |
| HEPES | SIGMA | H3375 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| Humidified non-CO2 incubator | Fisher Scientific | 11-683-230D | To hydrate plates at 37 °C |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | SIGMA | O4876 | To inhibit mitochondrial ATP synthase |
| Parafilm | SIGMA-ALDRICH | sealing film | |
| Rotenone | Tocris | 3616 | To inhibit complex I of the mitochondria |
| Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL | Seahorse Bioscience | 103681-100 | Solution for seahorse calibration |
| Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation | |
| Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation | |
| Seahorse XF24 FluxPaks | Seahorse Bioscience | 101174-100 | Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens, calibrant solution and calibration plates; assay kit. |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply |
| Stainless steel biopsy punches | Miltex | Device used to punch slices | |
| Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm | Eppendrof | 0030700102 | Used for slice punch |
| Vibratome | Leica | VT1200 | To slice brain tissue |
| Water bath | Thermo Scientific Precision | 282-115 | To heat buffer and solutions |
References
- Hauser, D. N., Hastings, T. G. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson's disease and monogenic parkinsonism. Neurobiology of Disease. 51, 35-42 (2013).
- Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 62 (3), 1403-1416 (2018).
- Lou, S., et al. Oxygen consumption deficit in Huntington disease mouse brain under metabolic stress. Human Molecular Genetics. 25 (13), 2813-2826 (2016).
- Amo, T., et al. Mitochondrial membrane potential decrease caused by loss of PINK1 is not due to proton leak, but to respiratory chain defects. Neurobiology of Disease. 41 (1), 111-118 (2011).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
- Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Science Translational Medicine. 4 (141), (2012).
- Gautier, C. A., Kitada, T., Shen, J. Loss of PINK1 causes mitochondrial functional defects and increased sensitivity to oxidative stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11364-11369 (2008).
- Gispert, S., et al. Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration. PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).
- Heeman, B., et al. Depletion of PINK1 affects mitochondrial metabolism, calcium homeostasis and energy maintenance. Journal of Cell Science. 124, Pt 7 1115-1125 (2011).
- Liu, W., et al. Pink1 regulates the oxidative phosphorylation machinery via mitochondrial fission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12920-12924 (2011).
- Villeneuve, L. M., Purnell, P. R., Boska, M. D., Fox, H. S. Early expression of Parkinson's disease-related mitochondrial abnormalities in PINK1 knockout rats. Molecular Neurobiology. 53 (1), 171-186 (2016).
- Morais, V. A., et al. PINK1 loss-of-function mutations affect mitochondrial complex I activity via NdufA10 ubiquinone uncoupling. Science. 344 (6180), 203-207 (2014).
- Morais, V. A., et al. Parkinson's disease mutations in PINK1 result in decreased Complex I activity and deficient synaptic function. EMBO Molecular Medicine. 1 (2), 99-111 (2009).
- Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. The Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
- Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux. Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. In situ respiration and bioenergetic status of mitochondria in primary cerebellar granule neuronal cultures exposed continuously to glutamate. The Journal of Biological Chemistry. 279 (31), 32989-33000 (2004).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Land, S. C., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Smith, P. J. The self-referencing oxygen-selective microelectrode: detection of transmembrane oxygen flux from single cells. TheJournal of Experimental Biology. 202, Pt 2 211-218 (1999).
- Sure, V. N., et al. A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice. Geroscience. 40 (4), 365-375 (2018).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Schuh, R. A., et al. Adaptation of microplate-based respirometry for hippocampal slices and analysis of respiratory capacity. Journal of Neuroscience Research. 89 (12), 1979-1988 (2011).
- Zhi, L., et al. Loss of PINK1 causes age-dependent decrease of dopamine release and mitochondrial dysfunction. Neurobiology of Aging. 75, 1-10 (2019).
- Fried, N. T., Moffat, C., Seifert, E. L., Oshinsky, M. L. Functional mitochondrial analysis in acute brain sections from adult rats reveals mitochondrial dysfunction in a rat model of migraine. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (11), 1017-1030 (2014).
- Qi, G., Mi, Y., Yin, F. Characterizing brain metabolic function ex vivo with acute mouse slice punches. STAR Protocols. 2 (2), 100559 (2021).
- Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions. Scientific Reports. 10 (1), 13179 (2020).
