Dobbeltfarvningsmetode til påvisning af pektin i interaktion mellem plante og svampe

Denne protokol er vigtig, da den gør det muligt at identificere interaktionen mellem plante og svamp. Ud over at farve pektinet demonstrerer det også defekter på patogencellevægpolymeren og tillader identifikation af svampestrukturer. Denne enkle og ukomplicerede teknik kan udføres ved hjælp af lysmikroskopi, og det kræver ikke noget dyrt udstyr såsom scanningselektronmikroskop.

Derudover er det en hurtig teknik, der opnår en fremragende sondring af plantestrukturer til histopatologiske undersøgelser. Teknikken identificerer interaktionen mellem plante og svamp. Derfor samarbejder det om at diagnosticere sygdomme forårsaget af biotrofiske og nekrotrofe svampe som kafferust og cercosporiosis.

Til at begynde med høstes og ca. 10 kvadratmillimeter bladprøve i den midterste del af læsionen ved hjælp af en skalpel og pincet, og nedsænk den i 30 ml Karnovsky fikseringsopløsning. Bladprøven udsættes for et lavt vakuum på 500 til 600 millibar i 15 minutter ved hjælp af en oliepumpe, mindst fire gange for at øge permeabiliteten af den fikserende opløsning i bladvævet. Efter fiksering vaskes bladprøven tre gange i 0,5 M kakodylatbuffer fortyndet i destilleret vand i fem minutter hver, og overføres derefter til en gradueret ethanolserie i 15 minutter ved hver ethanolkoncentration.

For gradvist at overføre prøverne til glycolmethacrylat fremstilles opløsning A ved at blande det ene gram glycolmethacrylatpulver med 100 ml basisk harpiks under magnetisk omrøring. Derefter nedsænkes prøverne i forholdet en til to af opløsning A og 100% ethanol i tre timer. Prøverne nedsænkes i forholdet et til en for opløsning A: 100% ethanol i tre timer, og nedsænkes derefter i en ren basisk harpiks i to til fire dage.

Prøven udsættes for et lavt vakuum mindst fire gange om dagen i 15 minutter efterfulgt af rotation. Bland 15 ml opløsning A med en milliliter hærder i et bægerglas med rotation i to minutter for at fremstille polymerisationsopløsningen B.Sæt 1,2 ml af denne polymerisationsopløsning B i plastforme. Brug en træplukker til at overføre de læsionerede bladprøver fra ren basisk harpiks til opløsning B og undgå at bruge pincet, da de kan forårsage vævsknusning.

Sørg for hurtigt at orientere bladprøver vinkelret på plastformene, da løsning B hurtigt bliver tyktflydende. Når den vinkelrette orientering af bladprøverne er opnået, skal du vente i 30 minutter og derefter overføre plastformen til et plast- eller glaskammer indeholdende silicagel for at forhindre fugtighed. Når harpiksen og bladprøven er polymeriseret efter to til tre timer, skal du løsne den resulterende blok fra plastformen ved at slibe blokbasen med en slibefil.

Lim derefter blokken på et stykke træ. Skær blokken i fem mikrometer tykke sektioner ved hjælp af en roterende mikrotome udstyret med otte centimeter stålblade. Placer sektionerne på glasrutschebaner dækket med destilleret vand.

Overfør derefter diasene til en kogeplade for at tørre ved 40 grader Celsius og fremme vedhæftningen af sektionerne til glasdiasene. Efter tørring skal du mærke glasdiasene med blokreferencenavnet og diasnummeret. Dæk sektionerne med to ml 5% bomuldsblå i lactophenol og opvarm dem på en kogeplade ved 45 grader Celsius i fem minutter.

Fjern det overskydende farvestof ved at vaske diaset tre gange i et bægerglas fyldt med destilleret vand. Plet det med to milliliter 0,01% rutheniumrødt i vand i et minut. Fjern det overskydende farvestof ved at vaske diaset tre gange i et bægerglas fyldt med destilleret vand.

Sæt en dråbe destilleret vand over sektionerne og dæk sektionerne med en dækseddel til udførelse af lysmikroskopianalyse. I dobbeltfarvningsmetoden fremstod Hemileia vastatrix hyfer indeholdende cellevægge og det tætte protoplastindhold mørkeblåt i både svampet og palisadeparenkym. Haustoriummodercellen og haustoriaen udviste også en mørkeblå farve.

Tællerfarvningen med rutheniumrød klart defineret svampefordeling i de intercellulære rum. Under interaktionen brød Hemileia vastatrix haustorium modercelle værtscellevæggen og udviklede en haustorial hals omgivet af pektiske forbindelser. Den pektinrige pink-rødfarvede indkapsling af haustorialhalsen kan ikke forhindre haustorial dannelse.

I nogle tilfælde indkapslede den pektinrige indkapsling haustorium ufuldstændigt. Og i nogle tilfælde er haustoriumet fuldt indkapslet. Den pektinrige cellevæg opretholder integriteten ved læsionsgrænsen, hvor svampen ikke er til stede.

Den dobbelte farvningsmetode demonstrerede tilstedeværelsen af intercellulære hyfer. I interaktionszoner syntes pektincellevægge at miste deres integritet på grund af opløsning. Reproduktive strukturer såsom conidia blev fundet i den adaksiale epidermis.

Cercospora coffeicola hyfer blev fundet i det substomatiske kammer som krøllestrukturer, og palisadeparenchymen i læsionsområdet ser ud til at gennemgå cellevægslyse. Undgå at bruge pincet, da de kan forårsage vævsknusning. Yderligere histopatologiske undersøgelser af rust, anthracnose, cercosporiosis, smuts og andre biotrofiske, hæmimbiotrofe og nekrotrofe plante-svampeinteraktioner bør udføres for at undersøge den potentielle anvendelse af denne teknik i forskellige patosystemer.