Biology
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संयंत्र-कवक इंटरैक्शन में पेक्टिन का पता लगाने के लिए डबल-स्टेनिंग विधि
Chapters
Summary February 4th, 2022
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यह प्रोटोकॉल कॉफी-कवक इंटरैक्शन में पेक्टिन का पता लगाने के लिए एक माइक्रोस्कोपिक विधि का वर्णन करता है।
Transcript
यह प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है क्योंकि यह पौधे-कवक बातचीत की पहचान करना संभव बनाता है। पेक्टिन को रंगने के अलावा, यह रोगज़नक़ सेल दीवार बहुलक पर दोषों को भी प्रदर्शित करता है और कवक संरचनाओं की पहचान की अनुमति देता है। इस सरल और सरल तकनीक को प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके किया जा सकता है और इसे स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप जैसे किसी भी महंगे उपकरण की आवश्यकता नहीं होती है।
इसके अलावा, यह एक तेज़ तकनीक है जो हिस्टोपैथोलॉजिकल अध्ययन के लिए पौधे की संरचनाओं का एक उत्कृष्ट अंतर प्राप्त करती है। तकनीक पौधे-कवक बातचीत की पहचान करती है। इसलिए, यह बायोट्रॉफिक और नेक्रोट्रॉफिक कवक जैसे कॉफी जंग और सर्व्कोस्पोरियोसिस के कारण होने वाली बीमारियों का निदान करने के लिए सहयोग करता है।
शुरू करने के लिए, एक स्केलपेल और चिमटी का उपयोग करके घाव के मध्य क्षेत्र में फसल और लगभग 10 वर्ग मिलीमीटर पत्ती का नमूना, और इसे 30 मिलीलीटर कार्नोव्स्की फिक्सेटिव समाधान में विसर्जित करें। एक तेल पंप का उपयोग करके 15 मिनट के लिए 500 से 600 मिलीबार के कम वैक्यूम के लिए पत्ती के नमूने को विषय, पत्ती के ऊतकों में फिक्सेटिव समाधान की पारगम्यता को बढ़ाने के लिए कम से कम चार बार। निर्धारण के बाद, पत्ती के नमूने को 0.5 एम कैशोडिलेट बफर में तीन बार धोएं, प्रत्येक पांच मिनट के लिए आसुत पानी में पतला हो गया, और फिर इसे प्रत्येक इथेनॉल एकाग्रता पर 15 मिनट के लिए एक वर्गीकृत इथेनॉलिक श्रृंखला में स्थानांतरित करें।
धीरे-धीरे नमूनों को ग्लाइकोल मेथाक्रिलेट में स्थानांतरित करने के लिए, चुंबकीय आंदोलन के तहत 100 मिलीलीटर मूल राल के साथ ग्लाइकोल मेथाक्रिलेट पाउडर के एक ग्राम को मिलाकर समाधान ए बनाएं। फिर, तीन घंटे के लिए समाधान ए और 100% इथेनॉल के एक से दो के अनुपात में नमूनों को विसर्जित करें। तीन घंटे के लिए समाधान A: 100% इथेनॉल के लिए एक से एक के अनुपात में नमूनों को विसर्जित करें, फिर दो से चार दिनों के लिए एक शुद्ध बुनियादी राल में विसर्जित करें।
नमूने को 15 मिनट के लिए दिन में कम से कम चार बार कम वैक्यूम के अधीन करें, इसके बाद रोटेशन किया जाए। दो मिनट के लिए रोटेशन के साथ एक बीकर में हार्डनर के एक मिलीलीटर के साथ समाधान A के 15 मिलीलीटर मिश्रण B.Put प्लास्टिक मोल्ड्स में इस पोलीमराइजेशन समाधान बी के 1.2 मिलीलीटर का उत्पादन करने के लिए। एक लकड़ी के पिक का उपयोग करते हुए, घाव वाले पत्ती के नमूनों को शुद्ध बुनियादी राल से समाधान बी में स्थानांतरित करें और चिमटी का उपयोग करने से बचें क्योंकि वे ऊतक कुचलने का कारण बन सकते हैं।
जल्दी से प्लास्टिक molds के लिए लंबवत पत्ती के नमूनों उन्मुख करने के लिए सुनिश्चित करें के रूप में समाधान बी जल्दी से चिपचिपा हो जाता है. जब पत्ती के नमूनों का लंबवत अभिविन्यास प्राप्त किया जाता है, तो 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें और फिर नमी को रोकने के लिए सिलिका जेल युक्त प्लास्टिक या ग्लास चैंबर में प्लास्टिक मोल्ड को स्थानांतरित करें। एक बार राल और पत्ती के नमूने को दो से तीन घंटे के बाद पॉलिमराइज़ किया जाता है, तो एक सैंडिंग फ़ाइल के साथ ब्लॉक बेस को सैंड करके प्लास्टिक मोल्ड से परिणामी ब्लॉक को अलग करें।
फिर, ब्लॉक को लकड़ी के एक टुकड़े से गोंद करें। आठ सेंटीमीटर स्टील ब्लेड से सुसज्जित घूर्णन माइक्रोटोम का उपयोग करके ब्लॉक को पांच माइक्रोमीटर मोटे वर्गों में काटें। आसुत पानी से ढके कांच की स्लाइड्स पर अनुभागों को रखें।
फिर, स्लाइड को 40 डिग्री सेल्सियस पर सूखने के लिए एक गर्म प्लेट में स्थानांतरित करें और ग्लास स्लाइड्स में अनुभागों के आसंजन को बढ़ावा दें। सूखने के बाद, ब्लॉक संदर्भ नाम और स्लाइड नंबर के साथ ग्लास स्लाइड को लेबल करें। लैक्टोफेनोल में 5% कपास नीले रंग के दो मिलीलीटर के साथ वर्गों को कवर करें और उन्हें पांच मिनट के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट पर गर्म करें।
आसुत पानी से भरे बीकर में स्लाइड को तीन बार धोकर अतिरिक्त डाई को हटा दें। इसे एक मिनट के लिए पानी में 0.01% रूथेनियम लाल के दो मिलीलीटर के साथ दाग दें। आसुत पानी से भरे बीकर में स्लाइड को तीन बार धोकर अतिरिक्त डाई को हटा दें।
वर्गों पर आसुत पानी की एक बूंद रखो और प्रकाश माइक्रोस्कोपी विश्लेषण करने के लिए एक कवर पर्ची के साथ वर्गों को कवर करें। डबल धुंधला विधि में, हेमिलिया vastatrix hyphae सेल दीवारों और घने protoplasts सामग्री युक्त दोनों स्पंजी और palisade पैरेन्काइमा में गहरे नीले रंग में दिखाई दिया. हौस्टोरियम मदर सेल और हौस्टोरिया ने भी एक गहरे नीले रंग का प्रदर्शन किया।
रूथेनियम लाल के साथ काउंटर धुंधला स्पष्ट रूप से अंतरकोशिकीय रिक्त स्थान में कवक वितरण परिभाषित किया। बातचीत के दौरान, हेमिलिया वास्ताट्रिक्स हॉस्टोरियम मदर सेल ने मेजबान सेल की दीवार को तोड़ दिया और पेक्टिक यौगिकों से घिरा एक हौस्टोरियल गर्दन विकसित की। हस्टोरियल गर्दन के पेक्टिन-समृद्ध गुलाबी-लाल रंग के एनकैप्सुलेशन हॉस्टोरियल गठन को रोक नहीं सकते हैं।
कुछ मामलों में, पेक्टिन-समृद्ध एनकैप्सुलेशन ने हॉस्टोरियम को अपूर्ण रूप से घेर लिया। और कुछ मामलों में, haustorium पूरी तरह से encapsulated है। पेक्टिन समृद्ध सेल की दीवार घाव सीमा पर अखंडता को बनाए रखती है, जहां कवक मौजूद नहीं है।
डबल धुंधला विधि अंतरकोशिकीय hyphae की उपस्थिति का प्रदर्शन किया. इंटरैक्शन ज़ोन में, पेक्टिन सेल की दीवारें विघटन के कारण अपनी अखंडता खोने के लिए दिखाई दीं। कोनिडिया जैसी प्रजनन संरचनाएं एडैक्सियल एपिडर्मिस में पाई गई थीं।
Cercospora coffeicola hyphae कर्लिंग संरचनाओं के रूप में substomatic कक्ष में पाए गए थे, और घाव क्षेत्र में palisade पैरेन्काइमा सेल दीवार lysis से गुजरना प्रतीत होता है। चिमटी का उपयोग करने से बचें क्योंकि वे ऊतक कुचलने का कारण बन सकते हैं। जंग, एंथ्राकनोज़, सर्कोस्पोरिओसिस, स्मट्स और अन्य बायोट्रोफिक, हेमीबियोट्रोफिक, और नेक्रोट्रोफिक प्लांट-फंगल इंटरैक्शन पर आगे हिस्टोपैथोलॉजिकल अध्ययन विभिन्न पैथोसिस्टम में इस तकनीक के संभावित उपयोग की जांच करने के लिए आयोजित किया जाना चाहिए।
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