Biology
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肝组织3D细胞培养模型中组蛋白翻译后修饰的全球水平定量
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该协议概述了如何使用三维细胞培养系统在接近生理状态下对染色质修饰进行建模，治疗和分析。
Transcript
全球染色质动力学已被证明是几种疾病状态（如癌症和衰老）的重要介质。我们的方案提供了一个生理相关的模型来研究这一过程。组蛋白翻译后修饰或 PTMS 的标准实验室分析通常仅限于使用基于抗体的检测一次探测单个 PTM。
组蛋白PTMS的液相色谱质谱分析使我们能够在单个实验中测量数百个PTMS的丰度。演示该程序的将是Stephanie Stransky，Ronald Cutler和Julie Kim，分别是实验室的博士后，研究生和研究技术。首先，使用标准生长培养基，将细胞作为单层生长，直到它们汇合80%。
然后用HBSS洗涤细胞。加入五毫升在HBSS中稀释的0.05%胰蛋白酶-EDTA。将细胞在37摄氏度下用5%二氧化碳孵育5分钟。
使用显微镜检查细胞脱离。计数细胞后，用新鲜的生长培养基稀释细胞悬浮液。加入0.5毫升生长培养基，以平衡超低附着24孔圆底板，每个底板有多个微孔。
然后将板以3000×g离心以除去板表面的气泡。现在将先前制造的细胞悬浮液转移到24孔板上，并以120×g离心三分钟。检查24孔板中的细胞，然后将板在37摄氏度下用5%二氧化碳孵育24小时以形成球体。
同时，为了平衡生物反应器，向湿度室中加入25毫升无菌水，向细胞室中加入9毫升生长培养基。将生物反应器在旋转的clinostat培养箱中，在37摄氏度下用5%二氧化碳孵育24小时。通过使用一毫升宽孔径吸头轻轻移液，将球体从超低附着24孔板中分离出来，并将其转移到组织培养皿中。
为了选择足够形成的球体，在显微镜下检查球体的质量。高质量的球体具有均匀的尺寸，紧凑性和圆度。用五毫升新鲜生长培养基填充平衡的生物反应器，并将球体转移到其中。
然后用新鲜的生长培养基完全填充生物反应器，并将生物反应器以10至11 RPM的转速放入clinostat培养箱中。每两到三天，通过用新鲜培养基替换10毫升旧培养基来交换生长培养基。随着这种球体的尺寸和数量的增加，增加培养箱的转速。
获得球状沉淀后，向沉淀中加入五体积的冷0.2摩尔硫酸，并上下移液以破坏沉淀并释放组蛋白。离心后获得上清液后，加入冷的浓缩三氯乙酸，使得最终浓度变为25~30%体积体积。并通过倒置管子几次并按照手稿中的描述离心来混合它。
弃去上清液后，使用玻璃牧场移液器，用约500微升冷丙酮和0.1%盐酸洗涤沉淀和管壁，然后在4摄氏度下以3， 400×g离心5分钟。然后翻转管以丢弃上清液。使用玻璃牧场移液器，加入500微升100%冷丙酮以洗涤沉淀并离心，如前所述。
弃去上清液后，小心移液完全除去丙酮，让样品用打开的盖子干燥约20分钟。将沉淀重悬于20微升15至20%乙腈中，在pH值为8的100毫摩尔碳酸氢铵中。涡旋后，以1000 x g旋转悬浮液30秒。
对于八个或更多样品，将每个重新悬浮的样品转移到96孔板中。然后，在罩中加入两微升丙酸酐，并通过移液五次混合。快速加入10微升氢氧化铵，移液5次混合。
在磁力搅拌板上混合HLB树脂。然后将70微升的HLB悬浮液添加到96孔收集板上的96孔过滤板的每个孔中。丢弃流经后，用100微升0.1%三氟乙酸洗涤树脂。
将每个样品重悬于100微升0.1%三氟乙酸中后，在每个孔中加载每个样品并使用真空防止飞溅。丢弃流经后，用100微升0.1%三氟乙酸洗涤样品，并将过滤板放在新的收集板上。接下来，在每个孔中加入60微升60%乙腈的0.1%三氟乙酸，并用真空防止飞溅。
收集流经并在高速真空中干燥。将干燥的收集板装入HPLC中，并按照手稿中所述运行LC / MS / MS方法。在这项研究中，在作为三维球体生长的C3A肝细胞中观察到常见组蛋白翻译后修饰的相对丰度。
翻译后修饰也可以在组蛋白产生的肽中的单个残基上观察到。用丁酸钠处理球状体增加了组蛋白乙酰化的相对丰度，而用琥珀酸钠治疗则增强了组蛋白残基琥珀酰化。该方法还证明了丁酸钠处理后组蛋白乙酰化和琥珀酸钠处理后组蛋白琥珀酰化的分布模式。
结果还显示了不同组蛋白修饰的共性模式。丁酸钠处理显着增强赖氨酸残基14在组蛋白H3产生的肽上的乙酰化，只有当其第九赖氨酸残基具有两个甲基，而不是一个或三个甲基时。还计算了H3衍生肽中个体修饰和翻译后修饰的各种组合的相对丰度。
在由组蛋白H4产生的肽中也观察到丁酸钠处理后翻译后修饰的组合模式。在这里，丁酸钠处理也导致乙酰化显着增加。应特别注意将球体保持在工作台上尽可能少，并进行脱盐步骤，以避免样品溢出。该工作流程可用于使用比快速复制扁平细胞培养物更生理的模型来探索固体组织中的染色质。
Tags
生物学，第183期，3D培养，组蛋白，质谱，直喷，翻译后修饰Related Videos
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