Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue

Van de wereldwijde chromatinedynamiek is aangetoond dat het een belangrijke bemiddelaar is van verschillende ziektetoestanden, zoals kanker en veroudering. Ons protocol biedt een fysiologisch relevant model om dit proces te bestuderen. Standaard laboratoriumanalyse van histon posttranslationele modificaties of PTMS is meestal beperkt tot het onderzoeken van een enkele PTM per keer met behulp van op antilichamen gebaseerde assays.

Vloeistofchromatografie massaspectrometrie analyse van histon PTMS stelt ons in staat om de overvloed van honderden PTMS in een enkel experiment te meten. Stephanie Stransky, Ronald Cutler en Julie Kim, respectievelijk een postdoc, grad student en onderzoekstechnologie van het lab, demonstreren de procedure. Eerst, met behulp van standaard groeimedia, groeien de cellen als een monolaag totdat ze 80% confluent zijn.

Was vervolgens de cellen met HBSS. Voeg vijf milliliter van 0,05% trypsine-EDTA verdund in HBSS toe. Incubeer de cellen gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.

Gebruik een microscoop om de loslating van cellen te controleren. Na het tellen van de cellen, verdun de celsuspensie met verse groeimedia. Voeg 0,5 milliliter groeimedia toe om een ultralaag opzetstuk van 24-putjes met meerdere microputten in elk in evenwicht te brengen.

Centrifugeer vervolgens de platen bij 3000 x g om luchtbellen van het oppervlak van de plaat te verwijderen. Breng nu de eerder gemaakte celsuspensie over op de 24-wells plaat en centrifugeer gedurende drie minuten bij 120 x g. Controleer de cellen in de 24-well plaat en incubeer vervolgens de platen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 24 uur op sferoïde vorming.

Voeg ondertussen, om de bioreactor in evenwicht te brengen, 25 milliliter steriel water toe aan de vochtigheidskamer en negen milliliter groeimedia aan de celkamer. Incubeer de bioreactor in een roterende clinostat incubator gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Maak de sferoïden los van de ultralage 24-putplaat door voorzichtig te pipetteren met behulp van een milliliter brede boorpunten en breng ze over naar een weefselkweekschaal.

Om voldoende vormen van sferoïden te selecteren, controleert u de kwaliteit van sferoïden onder een microscoop. Sferoïden van goede kwaliteit hebben een uniforme grootte, compactheid en rondheid. Vul de gebalanceerde bioreactor met vijf milliliter verse groeimedia en breng de sferoïden erin over.

Vul vervolgens de bioreactor volledig met verse groeimedia en zet de bioreactor in de clinostat incubator bij 10 tot 11 RPM. Wissel elke twee tot drie dagen groeimedia uit door 10 milliliter oude media te vervangen door verse media. Naarmate deze sferoïden in grootte en aantal toenemen, verhoogt u de rotatiesnelheid van de incubator.

Voeg na het verkrijgen van de sferoïde pellet vijf volumes koud 0,2 molair zwavelzuur toe aan de pellet en pipetteer op en neer om de pellet te verstoren en histonen vrij te geven. Zodra het supernatant na centrifugering is verkregen, voegt u koud geconcentreerd trichloorazijnzuur toe, zodat de uiteindelijke concentratie 25 tot 30 volumeprocent wordt. En meng het door de buis een paar keer om te keren en te centrifugeren zoals beschreven in het manuscript.

Na het weggooien van het supernatant, met behulp van een glazen weidepipet, wast u de pellet en de wanden van de buis met ongeveer 500 microliter koud aceton en 0,1% zoutzuur en centrifugeert u vervolgens op 3.400 x g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Draai vervolgens de buis om om het supernatant weg te gooien. Voeg met behulp van een glazen weidepipet 500 microliter 100% koude aceton toe om de pellet en centrifuge te wassen zoals eerder gedemonstreerd.

Verwijder na het weggooien van het supernatant aceton volledig door voorzichtig te pipetteren en laat het monster ongeveer 20 minuten drogen met een open deksel. Resuspend de pellet in 20 microliter van 15 tot 20% acetonitril in een 100 millimolar ammoniumbicarbonaat van pH 8. Draai na het vortexen de suspensie gedurende 30 seconden op 1000 x g.

Breng voor acht of meer monsters elk opnieuw gesuspendeerd monster over op een plaat met 96 putten. Voeg vervolgens in een kap twee microliter propionzuuranhydride toe en meng door vijf keer te pipetteren. Voeg snel 10 microliter ammoniumhydroxide toe en meng door vijf keer te pipetteren.

Meng HLB-hars op een magneetroerplaat. Voeg vervolgens 70 microliter van de HLB-suspensie toe aan elke put van een 96-well filterplaat op een 96-wells opvangplaat. Na het weggooien van de doorstroom, wast u de hars met 100 microliter 0,1% trifluorazijnzuur.

Na resuspendatie van elk monster in 100 microliter van 0,1% trifluorazijnzuur, laadt u elk monster in elke put en voorkomt u spatten met behulp van een vacuüm. Na het weggooien van de doorstroom, wast u de monsters met 100 microliter 0,1% trifluorazijnzuur en plaatst u de filterplaat op een nieuwe opvangplaat. Voeg vervolgens 60 microliter 60% acetonitril in 0,1% trifluorazijnzuur toe aan elke put en voorkom spatten met behulp van vacuüm.

Vang de doorstroming op en droog in een snelheidsvacuüm. Plaats de gedroogde verzamelplaat in de HPLC en voer de LC/MS/MS-methode uit zoals beschreven in het manuscript. In deze studie werd de relatieve abundantie van gemeenschappelijke histon posttranslationele modificaties waargenomen in C3A-hepatocyten die als driedimensionale sferoïden werden gekweekt.

Posttranslationele modificaties konden ook worden waargenomen op een enkel residu in peptiden gegenereerd uit histoneiwitten. Behandeling van de sferoïden met natriumbutyraat verhoogde de relatieve abundantie van histonacetylering, terwijl die met natriumsuccinaat de histonresidusuccinylering verbeterde. De methode toonde ook het distributiepatroon van histonacetylering na behandeling met natriumbutyraat en dat van histonsuccinylering na behandeling met natriumsuccinaat.

Het resultaat toonde ook commonatoriële patronen van verschillende histonmodificaties. Natriumbutyraatbehandelingen verbeterden de acetylering van het lysineresidu 14 op een peptide gegenereerd uit het histoneiwit H3 aanzienlijk, alleen wanneer het negende lysineresidu twee methylgroepen had, maar niet één of drie methylgroepen. De relatieve abundanties van individuele modificaties en verschillende combinaties van posttranslationele modificaties in het van H3 afgeleide peptide werden ook berekend.

Combinatorische patronen van posttranslationele modificaties na behandeling met natriumbutyraat werden ook waargenomen in een peptide gegenereerd uit histoneiwit H4. Ook hier resulteerde de behandeling met natriumbutyraat in een significante toename van acetylering. Er moet kritisch op worden gelet dat de sferoïden zo min mogelijk op de bank blijven en in een ontzoutingsstap om morsen van het monster te voorkomen. Deze workflow kan worden gebruikt om chromatine in vaste weefsels te onderzoeken met behulp van een meer fysiologisch model dan snel replicerende platte celculturen.