Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
الوقت الذي تم حله في الجسم الحي قياس ديناميكيات Neuropeptide بواسطة مسبار مناعي سعوي في قلب لحم الخنزير
Chapters
Summary May 19th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
تعتمد الطرق الكيميائية المناعية المعمول بها لقياس أجهزة إرسال الببتيد في الجسم الحي على غسيل الكلى المجهري أو سحب السوائل السائبة للحصول على العينة لتحليلها في وضع عدم الاتصال. ومع ذلك ، فإن هذه تعاني من قيود مكانية زمنية. يصف هذا البروتوكول تصنيع وتطبيق جهاز استشعار حيوي مناعي سعوي يتغلب على قيود التقنيات الحالية.
Transcript
هذه هي المرة الأولى التي يتم فيها تطوير طريقة لقياس مستويات جهاز إرسال الببتيد في الجسم الحي بعد حلها زمنيا. يمكننا قياس مستويات إرسال الببتيد في مواضيع فردية ومواقع منفصلة مع تحليل في الوقت الفعلي تقريبا. أولا ، قطع طول 25 سم من الأسلاك البلاتينية المطلية بالفلور ألكوكسي.
ثم ، باستخدام مشرط ، قم بتجريد ما يقرب من خمسة ملليمترات من طلاء perfluoroalkoxy من طرف واحد ، مع الحرص على عدم قطع سلك البلاتين. الآن ، أدخل الطرف المجرد من السلك البلاتيني في دبوس موصل ذكر مطلي بالذهب ، مليمتر واحد. بعد ذلك ، باستخدام كماشة إبرة الأنف ، قم بتجعيد أسنان دبوس الموصل حول الطرف المجرد من السلك البلاتيني ولحام السلك البلاتيني بدبوس الموصل المطلي بالذهب.
بعد ذلك ، قم بإعداد محلول الدوبامين عن طريق إضافة 50 ملليغرام من هيدروكلوريد الدوبامين في 50 ملليلتر من PBS 10 ملليمول مع الرقم الهيدروجيني ستة واخلطه عن طريق التحريك. بعد إذابة الدوبامين تماما ، ضع طرف السلك البلاتيني في الوعاء الذي يحتوي على PBS المكمل بالدوبامين الطازج. قم بتوصيل قطب قرص كلوريد الفضة بالقناة الأرضية في مرحلة الرأس.
ثم ، ضع قرص كلوريد الفضة في الوعاء الذي يحتوي على PBS المكمل بالدوبامين وسلك البلاتين. قبل المضي قدما ، قم بتوصيل تحويلة سلكية بالقنوات المرجعية لمرحلة الرأس. افتح برنامج الحصول على البيانات التفاعلي واضبط بروتوكول جهد أمر الترسيب الكهربائي لأسنان المنشار عن طريق تعيين جهد البدء عند ناقص 0.6 فولت ، وجهد النهاية إلى 0.65 فولت ، ومعدل المسح الضوئي عند 0.04 فولت في الثانية ، ومدة الترسيب إلى 420 ثانية.
بعد الانتهاء من ترسيب الدوبامين ، قم بإزالة بيليه كلوريد الفضة المطحون وطرف سلك البلاتين من السفينة. ضع طرف السلك في أنبوب دقيق يحتوي على PBS من الرقم الهيدروجيني 7.4 لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق وتأكد من أن طرف السلك لا يلامس جانبي أو أسفل الأنبوب الدقيق. ثم ، قم بإعداد محلول الأجسام المضادة عن طريق الجمع بين الجسم المضاد محل الاهتمام مع PBS من الرقم الهيدروجيني 7.4 بنسبة 1:20 في وعاء بحجم مناسب.
بعد ذلك ، انقع الطرف المودع من القطب البلاتيني في محلول الأجسام المضادة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، مما يضمن تعليق طرف السلك البلاتيني في المحلول وعدم الاستلقاء على السطح الداخلي للأنبوب الدقيق. ضع الطرف الوظيفي للمحقق المناعي السعوي في غرفة التدفق ، مع الحرص على عدم إزعاج طرف القطب بأي شكل من الأشكال ، لأن القيام بذلك قد يؤدي إلى تلف الطرف الحسي للمسبار. قبل الاختبار التجريبي الأول ، قم بإجراء تشغيل قياسي TBS لتهيئة مسبار المسبار المناعي السعوي ، وبالنسبة لبروتوكول الجهد ، اضبط إمكانات الخطوة الإيجابية على 110 مللي فولت ، وإمكانات الخطوة السلبية إلى ناقص خمسة مللي فولت ، ومدة الخطوة من 20 مللي ثانية ، ومدة الاكتساب إلى 600 ثانية.
بعد ذلك ، قم بإنشاء محلول الببتيد المثير للاهتمام باستخدام نفس TBS للحفاظ على تكوين superfusate. قم بإعداد نظام متعدد حيث يمكن تبديل السوبرفوسات بين TBS و TBS المكمل بالببتيد. استخدم المعلمات القياسية TBS وقم بإعداد بروتوكول الحصول على بيانات استشعار الببتيد عن طريق تعيين مدة الاكتساب إلى 360 ثانية.
قبل ترسب الدوبامين المتعدد ، قم بربط الطرف المكشوف لقطب السلك البلاتيني من خلال إبرة تحت الجلد قياس 22 ، تاركا ما يقرب من مليمترين وراء طرف الإبرة. استخدم الملقط وثني طرف قطب السلك البلاتيني برفق لإنشاء شريط لاذع يتدلى من نهاية الإبرة تحت الجلد. اسحب الإبرة بلطف من الطرف الشائك ، تاركا ما يكفي من الأسلاك لوضعها في الوعاء دون أن تلامس الإبرة السائل والمضي قدما في ترسب الدوبامين كما هو موضح سابقا.
الآن ، شطف طرف المسبار الشائك باستخدام PBS وضعه في محلول الأجسام المضادة. ثم قم بإزالة الطرف الوظيفي بلطف من PBS. حرك الإبرة تحت الجلد إلى المسبار المناعي السعوي الشائك وازرعها بلطف في المنطقة ذات الأهمية قبل توصيل دبوس الموصل الذهبي بمرحلة الرأس.
بمجرد زرعها ، اسحب الإبرة تحت الجلد ، تاركا القطب الكهربائي في مكانه. تقيس الخطوة الإيجابية في جهد القيادة تيار الحقن المطلوب لتثبيت جهد المسبار وتسمح بقياس التيار السعوي. تقوم خطوة جهد الأمر السلبي بإزالة الببتيد المرتبط من الجسم المضاد عن طريق التنافر الكهروستاتيكي.
يصور الشكل الموجي لأمر وظيفة الخطوة الكشف التكراري الذي تم حله بمرور الوقت وتحديد كمية الببتيد. يمثل التتبع السفلي إمكانات القيادة والتيار الناتج تحت الانصهار الفائق للمسبار في TBS. أظهر المسبار المناعي السعوي المتوازن اضمحلالا أوليا أصغر وخط أساس مستقر على مدى ست دقائق.
أدى تدفق neuropeptide Y إلى غرفة التدفق إلى زيادة التيارات السعوية فوق خط الأساس. أظهرت تيارات المسبار المناعي السعوي التي تم قياسها باستخدام مسبار وظيفي للأجسام المضادة neuropeptide Y إشارة تعتمد على التركيز حساسة ل neuropeptide منخفض البيكومول Y للمعايرة ، تم قياس منحنى قياسي لجميع التركيزات المختبرة. أظهر تحفيز العقدة النجمية الثنائية ارتفاع neuropeptide Y عند التخطيط المشترك مع التيارات السعوية للتحكم السلبي.
أظهر إطلاق النورادرينالين الذي تم قياسه تحت التحفيز النجمي إطلاقا متزامنا مع neuropeptide Y ، بما يتفق مع استجابة متعاطفة مستحثة. قد يوفر تطوير هذه التقنيات قراءات أثناء الجراحة للمعدلات الرئيسية لنشاط القلب ، وبالتالي توفير إرشادات علاجية أو تدخلية سريعة محتملة. التقنية كما هو موضح هنا محددة لنشر القلب والأوعية الدموية ، ومع ذلك ، فإن التقنية نفسها مناسبة للإعدادات الفسيولوجية الأخرى ، مثل البول والعضلات الهيكلية والكلى والأنسجة الدهنية وما إلى ذلك.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
