RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om microbiële kolonisatie en infectie in caenorhabditis elegans darmen te visualiseren

RNA FISH-kleuring is nuttig voor de visualisatie, identificatie en kwantificering van microben die van nature C.elegans koloniseren of infecteren, inclusief microbioombacteriën en intracellulaire pathogenen. Deze techniek is eenvoudig, snel en robuust, waardoor men microben effectief kan kleuren en visualiseren in de context van een heel intact dier. We kunnen RNA FISH gebruiken om darmmicrobioombacteriën in wilde C.elegans te detecteren en te visualiseren.

Dit kan ons helpen vergelijkbare interacties in zoogdiersystemen te begrijpen. Na het overbrengen van nematoden met de gewenste microbe van belang, van NGM-platen tot microcentrifugebuizen, wast u de nematoden door één milliliter 1X PBST aan microfugebuizen toe te voegen. Draai de monsters in een microcentrifuge of Nanofuge met de juiste snelheid.

Verwijder met een pipet alle microliter van het supernatant op 100 na. Herhaal het wassen met PBST twee tot drie keer. Om de nematoden te fixeren met paraformaldehyde, begint u met het toevoegen van 33 microliter 16% paraformaldehyde aan de microfugebuis met 100 microliter supernatant boven de nematodenpellet voor een uiteindelijke concentratie van 4% paraformaldehyde.

Incubeer de monsters met de nematoden gekoloniseerd of geïnfecteerd met de microbe van belang gedurende 30 tot 45 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de paraformaldehyde-oplossing en voeg 0,5 milliliter PBST toe aan de monsters. Draai de monsters in een microcentrifuge met de juiste snelheid zoals vermeld in het tekstmanuscript.

Verwijder met een pipet zoveel mogelijk van het supernatant zonder de pellet te verstoren. Voeg 0,5 milliliter PBST toe aan de monsters in de microfugebuizen. Herhaal het wassen met PBST twee tot drie keer.

Na de laatste wasbeurt draait u de monsters af en verwijdert u het supernatant, waarbij u de pellet ongestoord laat. Bereid vervolgens één milliliter hybridisatiebuffer per monster voor. Voeg 800 microliter hybridisatiebuffer toe aan de microfugebuizen die de nematodenpellet bevatten.

Pelleteer de monsters in de microcentrifuge. Verwijder het supernatant zonder de pellet te storen. Bereid 100 microliter per monster hybridisatiebuffer met de gewenste FISH-sonde voor tot een eindconcentratie van 5 tot 10 nanogram per microlitersonde en vortex om te mengen.

Voeg 100 microliter hybridisatiebuffer met FISH-sonde toe aan elk monster. Meng door de buizen voorzichtig te vegen of om te keren. Incubeer de monsters ‘s nachts in een droog bad bij 46 tot 54 graden Celsius of een thermische mixer bij 46 tot 54 graden Celsius bij 1.200 omwentelingen per minuut.

Bereid drie milliliter wasbuffer per monster. Centrifugeer de monsters met de juiste snelheid. Verwijder de hybridisatiebuffer met een pipet terwijl u voorzichtig bent om de nematodenpellet ongestoord te laten.

Voeg aan elk monster één milliliter bereide wasbuffer toe. Centrifugeer de monsters met de juiste snelheid. Verwijder de wasbuffer met een pipet, terwijl u voorzichtig bent om de pellet ongestoord te laten.

Voeg aan elk monster één milliliter bereide wasbuffer toe. Incubeer de monsters gedurende een uur bij 48 tot 56 graden Celsius in een droog bad of thermische mixer bij 48 tot 56 graden Celsius bij 1.200 omwentelingen per minuut. Als u in een droog bad broedt, keert u de buizen voorzichtig om de 15 tot 20 minuten.

Centrifugeer de monsters met de juiste snelheid. Verwijder met een pipet de wasbuffer, terwijl u voorzichtig bent om de pellet ongestoord te laten. Voeg 100 tot 500 microliter PBST toe aan elk van de monsters.

Op dit punt kunnen de monsters maximaal een week in PBST bij vier graden Celsius worden bewaard totdat het protocol klaar is om te worden voortgezet. Pelleteer de monsters met de juiste snelheid. Verwijder zoveel mogelijk PBST zonder de aaltjeskorrel te storen.

Voeg 20 microliter anti-fade montagemedium met DAPI toe aan de monsters. Laad een pipetter van 20 microliter met een pipetpunt van 200 microliter en gebruik een schaar om de punt van de pipet af te knippen zodat grotere nematoden kunnen worden gepipetteerd. Breng met de gesneden pipetpunt 5 tot 10 microliter van de pellet over op een microscoopglaasje.

Dek af met een 22 bij 22 coverslip. Om de dia’s op te slaan, sluit u de randen van de coverslip af met nagellak en bewaart u ze in een donkere doos op vier graden Celsius totdat ze klaar zijn voor verder gebruik. Onder de differentiële interferentiecontrastmicroscoop bleek een wilde Caenorhabditis tropicalis-stam te zijn gekoloniseerd met een bacterie die zich richtinggevend aan het darmepitheel lijkt te hechten.

Fluorescerend signaal van de groene universele 16S rRNA-sonde en de rode Alphaproteobacteria-soortensonde overlappen volledig, wat suggereert dat de meeste bacteriën die de darmen koloniseren de aanhangende Alphaproteobacteria-bacterie zijn. Het bipartiete RNA-genoom van het Orsay-virus bestaat uit RNA1- en RNA2-segmenten en er zijn FISH-probes ontwikkeld die zich op beide segmenten richten. ZIP1-eiwit gelabeld met groen fluorescerend eiwit wordt gezien gelokaliseerd in de darmkernen van cellen die positieve Orsay-virus FISH-kleuring in het cytoplasma vertonen.

Meerdere dieren gekleurd met Orsay-specifieke of N.parisii-specifieke FISH blijken de sterkte van dit signaal aan te geven voor eenvoudige kwantificering. Co-infectie van C.elegans met twee microsporidia-parasieten met behulp van soortspecifieke sondes die concurreren om binding aan de 18S, het gebruik van DAPI om kernen te kleuren zorgt voor een betere lokalisatie van de infectie in de context van het hele dier, vooral voor de darm met grote, gemakkelijk identificeerbare kernen. Infecties met N.parisii resulteren in de ontwikkeling van meronts tot sporen.

De resulterende FISH-kleuring toont kleine en grote staafvormige structuren die waarschijnlijk overeenkomen met N.parisii-sporen, die zijn gekleurd met N.parisii-specifieke sondes in rood. Onthoud bij het selecteren van het fixatieve middel dat PFA-fixatie zorgt voor een beter behoud van morfologie en transgene GFP, maar acetonfixatie is noodzakelijk voor de visualisatie van sporoplasmata. RNA FISH kan worden gebruikt om bacteriën te identificeren en te visualiseren die de darmen van C.elegans koloniseren.

Onderzoekers kunnen dan meer genetische screenings uitvoeren om factoren te identificeren die betrokken zijn bij deze gastheer-microbe interacties.