3,486 Views
•
08:58 min
•
July 27, 2022
DOI:
Окрашивание РНК FISH полезно для визуализации, идентификации и количественной оценки микробов, которые естественным образом колонизируют или заражают C.elegans, включая бактерии микробиома и внутриклеточные патогены. Этот метод прост, быстр и надежен, что позволяет эффективно окрашивать и визуализировать микробы в контексте целого неповрежденного животного. Мы можем использовать РНК FISH для обнаружения и визуализации бактерий кишечного микробиома в диких C.elegans.
Это может помочь нам понять сопоставимые взаимодействия в системах млекопитающих. После переноса нематод с желаемым микробом, представляющим интерес, от пластин NGM к микроцентрифужным трубкам, промывайте нематод, добавляя один миллилитр 1X PBST в микрофункционные трубки. Вращайте образцы в микроцентрифуге или нанофуге с соответствующей скоростью.
Используя пипетку, удалите все, кроме 100 микролитров супернатанта. Повторите промывку с ПБСТ два-три раза. Чтобы зафиксировать нематоды параформальдегидом, начните с добавления 33 микролитров 16%-ного параформальдегида в микрофьюжную трубку, содержащую 100 микролитров супернатанта над гранулой нематоды для конечной концентрации 4% параформальдегида.
Инкубируйте образцы, содержащие нематод, колонизированных или инфицированных интересующим микробом, в течение 30-45 минут при комнатной температуре. Удалите раствор параформальдегида и добавьте к образцам 0,5 миллилитра PBST. Вращайте образцы в микроцентрифуге с соответствующей скоростью, как указано в текстовой рукописи.
С помощью пипетки удалите как можно больше супернатанта, не нарушая гранулу. Добавьте 0,5 миллилитра PBST к образцам в микрофьюжных трубках. Повторите промывку с ПБСТ два-три раза.
После последней промывки открутите образцы и удалите супернатант, оставив гранулу нетронутой. Затем подготовьте один миллилитр буфера гибридизации на образец. Добавьте 800 микролитров буфера гибридизации к микрофьюж-трубкам, содержащим гранулу нематоды.
Гранулируйте образцы в микроцентрифуге. Удалите супернатант, не нарушая гранулу. Подготовьте 100 микролитров на образец буфера гибридизации с желаемым зондом FISH до конечной концентрации от 5 до 10 нанограммов на микролитр зонда и вихря для смешивания.
Добавьте 100 микролитров буфера гибридизации, содержащего зонд FISH, к каждому образцу. Перемешайте, осторожно щелкнув или перевернув трубки. Инкубируйте образцы в течение ночи в сухой ванне при температуре от 46 до 54 градусов Цельсия или в термомешалке при температуре от 46 до 54 градусов Цельсия при 1 200 оборотах в минуту.
Подготовьте три миллилитра промывочного буфера на образец. Центрифугирование образцов с соответствующей скоростью. Удалите буфер гибридизации с помощью пипетки, стараясь оставить гранулу нематоды нетронутой.
Добавьте один миллилитр подготовленного промывочного буфера к каждому образцу. Центрифугирование образцов с соответствующей скоростью. Снимите буфер для стирки с помощью пипетки, сохраняя при этом гранулу без помех.
Добавьте один миллилитр подготовленного промывочного буфера к каждому образцу. Инкубируйте образцы в течение одного часа при температуре от 48 до 56 градусов Цельсия в сухой ванне или термомешателе при температуре от 48 до 56 градусов Цельсия при 1 200 оборотах в минуту. При инкубации в сухой ванне осторожно переворачивайте трубки каждые 15-20 минут.
Центрифугирование образцов с соответствующей скоростью. Используя пипетку, снимите буфер для стирки, стараясь оставить гранулу нетронутой. Добавьте от 100 до 500 микролитров PBST к каждому из образцов.
На этом этапе образцы могут храниться в PBST при четырех градусах Цельсия в течение недели, пока протокол не будет готов к продолжению. Гранулируйте образцы с соответствующей скоростью. Удалите как можно больше PBST, не нарушая гранулу нематоды.
Добавьте к образцам 20 микролитров монтажной среды против выцветания с DAPI. Загрузите пипетку объемом 20 микролитров с наконечником пипетки объемом 200 микролитров и используйте ножницы, чтобы отрезать кончик пипетки, чтобы позволить пипетке более крупных нематод. Наконечником нарезанной пипетки переложите от 5 до 10 микролитров гранулы на предметное стекло микроскопа.
Обложка с чехлом 22 на 22. Чтобы сохранить слайды, запечатайте края крышки лаком для ногтей и храните их в темной коробке при четырех градусах Цельсия до готовности к дальнейшему использованию. Под дифференциальным интерференционным контрастным микроскопом было обнаружено, что дикий штамм Caenorhabditis tropicalis колонизирован бактерией, которая, по-видимому, направленно прилипает к кишечному эпителию.
Флуоресцентный сигнал от зеленого универсального зонда 16S рРНК и красного зонда видов альфапротеобактерий полностью перекрывается, предполагая, что большинство бактерий, колонизирующих кишечник, являются прилипшими бактериями альфапротеобактерий. Двудольный геном РНК вируса Орсе состоит из сегментов РНК1 и РНК2, и были разработаны зонды FISH, нацеленные на оба сегмента. Белок ZIP1, помеченный зеленым флуоресцентным белком, локализован в кишечных ядрах клеток, которые показывают положительное окрашивание вируса Orsay FISH в цитоплазме.
Показано, что несколько животных, окрашенных ORSAY-specific или N.parisii-specific FISH, указывают силу этого сигнала для легкой количественной оценки. Совместное заражение C.elegans двумя паразитами microsporidia с использованием видоспецифических зондов, которые конкурируют за связывание с 18S, использование DAPI для окрашивания ядер позволяет лучше локализовать инфекцию в контексте всего животного, особенно для кишечника, который имеет большие, легко идентифицируемые ядра. Инфекции N.parisii приводят к развитию меронтов в споры.
Полученное окрашивание FISH демонстрирует небольшие и крупные палочковидные структуры, которые, вероятно, соответствуют спорам N.parisii, которые окрашены специфическими для N.parisii зондами красного цвета. При выборе фиксирующего средства помните, что фиксация PFA позволяет лучше сохранить морфологию и трансгенный GFP, но фиксация ацетона необходима для визуализации спороплазм. РНК FISH может быть использована для идентификации и визуализации бактерий, колонизирующих кишечник C.elegans.
Затем исследователи могут выполнить больше генетических скринингов, чтобы определить факторы, участвующие в этих взаимодействиях между хозяином и микробом.
Кишечные микробы, включая внеклеточные бактерии и внутриклеточные патогены, такие как вирус Орсе и микроспоридия (грибы), часто связаны с дикими нематодами Caenorhabditis . В этой статье представлен протокол для обнаружения и количественной оценки микробов, которые колонизируют и / или заражают нематод C. elegans , а также для измерения патогенной нагрузки после контролируемых инфекций в лаборатории.
Read Article
Cite this Article
Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines. J. Vis. Exp. (185), e63980, doi:10.3791/63980 (2022).
Copy