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July 27, 2022
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आरएनए फिश धुंधला होना उन रोगाणुओं के विज़ुअलाइज़ेशन, पहचान और परिमाणीकरण के लिए उपयोगी है जो स्वाभाविक रूप से माइक्रोबायोम बैक्टीरिया और इंट्रासेल्युलर रोगजनकों सहित सी एलिगेंस को उपनिवेशित या संक्रमित करते हैं। यह तकनीक सरल, त्वरित और मजबूत है, जिससे एक पूरे बरकरार जानवर के संदर्भ में रोगाणुओं को प्रभावी ढंग से दाग और कल्पना करने की अनुमति मिलती है। हम जंगली सी एलिगेंस में आंत माइक्रोबायोम बैक्टीरिया का पता लगाने और कल्पना करने के लिए आरएनए फिश का उपयोग कर सकते हैं।
यह हमें स्तनधारी प्रणालियों में तुलनीय बातचीत को समझने में मदद कर सकता है। एनजीएम प्लेटों से माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में रुचि के वांछित माइक्रोब के साथ नेमाटोड को स्थानांतरित करने के बाद, माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में 1 एक्स पीबीएसटी के एक मिलीलीटर जोड़कर नेमाटोड को धो लें। नमूनों को उचित गति से माइक्रोसेंट्रीफ्यूज या नैनोफ्यूज में स्पिन करें।
पिपेट का उपयोग करके, सतह पर तैरने वाले के 100 माइक्रोलीटर को छोड़कर सभी को हटा दें। पीबीएसटी के साथ धोने को दो से तीन बार दोहराएं। पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ नेमाटोड को ठीक करने के लिए, माइक्रोफ्यूज ट्यूब में 16% पैराफॉर्मलडिहाइड के 33 माइक्रोलीटर जोड़कर शुरू करें जिसमें 4% पैराफॉर्मलडिहाइड की अंतिम एकाग्रता के लिए नेमाटोड गोली के ऊपर 100 माइक्रोलीटर सुपरनैटेंट होते हैं।
कमरे के तापमान पर 30 से 45 मिनट के लिए नेमाटोड वाले या माइक्रोब से संक्रमित नेमाटोड युक्त नमूनों को इनक्यूबेट करें। पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान निकालें और नमूने में 0.5 मिलीलीटर पीबीएसटी जोड़ें। पाठ पांडुलिपि में उल्लिखित उपयुक्त गति से एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में नमूने को स्पिन करें।
पिपेट के साथ, गोली को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना सतह पर तैरने वाला निकालें। माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में नमूने में 0.5 मिलीलीटर पीबीएसटी जोड़ें। पीबीएसटी के साथ धोने को दो से तीन बार दोहराएं।
अंतिम धोने के बाद, नमूनों को नीचे घुमाएं और सतह पर तैरने वाले को हटा दें, जिससे गोली अबाधित हो जाए। इसके बाद, प्रति नमूना संकरण बफर का एक मिलीलीटर तैयार करें। नेमाटोड गोली युक्त माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में संकरण बफर के 800 माइक्रोलीटर जोड़ें।
माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में नमूने को पेलेट करें। गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरने वाले को हटा दें। संकरण बफर के प्रति नमूने 100 माइक्रोलीटर तैयार करें, जिसमें वांछित फिश जांच के साथ 5 से 10 नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर जांच और मिश्रण करने के लिए भंवर की अंतिम एकाग्रता हो।
प्रत्येक नमूने में फिश जांच युक्त संकरण बफर के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। ट्यूबों को धीरे से फ्लिक या इनवर्ट करके मिलाएं। नमूनों को रात भर सूखे स्नान में 46 से 54 डिग्री सेल्सियस या थर्मल मिक्सर में 1,200 रोटेशन प्रति मिनट पर 46 से 54 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
प्रति नमूना तीन मिलीलीटर वॉश बफर तैयार करें। नमूनों को उचित गति से सेंट्रीफ्यूज करें। नेमाटोड गोली को अबाधित छोड़ने के लिए सावधान रहते हुए पिपेट का उपयोग करके संकरण बफर को हटा दें।
प्रत्येक नमूने में तैयार वॉश बफर का एक मिलीलीटर जोड़ें। नमूनों को उचित गति से सेंट्रीफ्यूज करें। पिपेट का उपयोग करके वॉश बफर को हटा दें, जबकि गोली को अबाधित छोड़ने के लिए सावधान रहें।
प्रत्येक नमूने में तैयार वॉश बफर का एक मिलीलीटर जोड़ें। नमूनों को 48 से 56 डिग्री सेल्सियस पर सूखे स्नान या थर्मल मिक्सर में 1,200 रोटेशन प्रति मिनट पर 48 से 56 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। यदि सूखे स्नान में इनक्यूबेट किया जाता है, तो धीरे से हर 15 से 20 मिनट में ट्यूबों को उलट दें।
नमूनों को उचित गति से सेंट्रीफ्यूज करें। पिपेट का उपयोग करके, वॉश बफर को हटा दें, जबकि गोली को अबाधित छोड़ने के लिए सावधान रहें। प्रत्येक नमूने में पीबीएसटी के 100 से 500 माइक्रोलीटर जोड़ें।
इस बिंदु पर, नमूने को पीबीएसटी में एक सप्ताह तक चार डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है जब तक कि प्रोटोकॉल जारी रखने के लिए तैयार न हो। उचित गति से नमूने को पेलेट करें। नेमाटोड गोली को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना पीबीएसटी हटा दें।
नमूने में DAPI के साथ एंटी-फेड माउंटिंग माध्यम के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें। 200 माइक्रोलीटर पिपेट टिप के साथ 20 माइक्रोलीटर पाइपेटर लोड करें और बड़े नेमाटोड को पाइपेट करने की अनुमति देने के लिए पिपेट की नोक को काटने के लिए कैंची का उपयोग करें। कट पिपेट टिप के साथ, एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर गोली के 5 से 10 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करें।
22 बाई 22 कवरस्लिप के साथ कवर करें। स्लाइड्स को स्टोर करने के लिए, कवरस्लिप के किनारों को नेल पॉलिश के साथ सील करें और उन्हें आगे के उपयोग के लिए तैयार होने तक चार डिग्री सेल्सियस पर एक अंधेरे बॉक्स में रखें। विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के तहत, एक जंगली केनोरहाबिटिस उष्णकटिबंधीय तनाव को एक जीवाणु के साथ उपनिवेशित पाया गया था जो आंतों के उपकला का दिशात्मक रूप से पालन करता प्रतीत होता है।
हरे सार्वभौमिक 16 एस आरआरएनए जांच और लाल अल्फाप्रोटियोबैक्टीरिया प्रजातियों की जांच से फ्लोरोसेंट सिग्नल पूरी तरह से ओवरलैप होते हैं, यह सुझाव देते हुए कि आंतों को उपनिवेशित करने वाले अधिकांश बैक्टीरिया अल्फाप्रोटियोबैक्टीरिया जीवाणु का पालन कर रहे हैं। ओरसे वायरस के द्विपक्षीय आरएनए जीनोम में आरएनए 1 और आरएनए 2 खंड होते हैं और दोनों खंडों को लक्षित करने वाली फिश जांच विकसित की गई है। हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग किए गए ज़िप 1 प्रोटीन को कोशिकाओं के आंतों के नाभिक में स्थानीयकृत देखा जाता है जो साइटोप्लाज्म में सकारात्मक ओरसे वायरस फिश धुंधला दिखाते हैं।
ओरसे-विशिष्ट या एन पेरिस-विशिष्ट मछली से सना कई जानवरों को आसान मात्रा के लिए इस संकेत की ताकत को इंगित करने के लिए दिखाया गया है। प्रजातियों-विशिष्ट जांच का उपयोग करके दो माइक्रोस्पोरिडिया परजीवी के साथ सी.एलिगेंस का सह-संक्रमण जो 18 एस को बांधने के लिए प्रतिस्पर्धा करता है, नाभिक को दागने के लिए डीएपीआई का उपयोग पूरे जानवर के संदर्भ में संक्रमण के बेहतर स्थानीयकरण की अनुमति देता है, खासकर आंत के लिए जिसमें बड़े, आसानी से पहचाने जाने योग्य नाभिक होते हैं। एन पेरिसी के साथ संक्रमण के परिणामस्वरूप बीजाणुओं में मेरोन्ट का विकास होता है।
परिणामस्वरूप मछली धुंधला होना छोटे और बड़े रॉड के आकार की संरचनाओं को प्रदर्शित करता है जो संभवतः एन पेरिसी बीजाणुओं के साथ मेल खाते हैं, जो लाल रंग में एन पेरिसी-विशिष्ट जांच से सना होता है। फिक्सेटिव एजेंट का चयन करते समय, याद रखें कि पीएफए निर्धारण आकृति विज्ञान और ट्रांसजेनिक जीएफपी के बेहतर संरक्षण की अनुमति देता है, लेकिन स्पोरोप्लाज्म के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एसीटोन निर्धारण आवश्यक है। आरएनए मछली का उपयोग सी.एलिगेंस आंतों को उपनिवेशित करने वाले बैक्टीरिया की पहचान और कल्पना करने के लिए किया जा सकता है।
शोधकर्ता तब इन मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन में शामिल कारकों की पहचान करने के लिए अधिक आनुवंशिक स्क्रीन कर सकते हैं।
आंतों के रोगाणुओं, जिसमें बाह्य बैक्टीरिया और इंट्रासेल्युलर रोगजनकों जैसे ओरसे वायरस और माइक्रोस्पोरिडिया (कवक) शामिल हैं, अक्सर जंगली केनोरहाब्डिस नेमाटोड से जुड़े होते हैं। यह लेख उन रोगाणुओं का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो सी एलिगेंस नेमाटोड को उपनिवेशित और / या संक्रमित करते हैं, और प्रयोगशाला में नियंत्रित संक्रमण के बाद रोगज़नक़ भार को मापने के लिए।
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Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines. J. Vis. Exp. (185), e63980, doi:10.3791/63980 (2022).
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