Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Grundlæggende om histologi og påvisning af celledød i honningbivæv
Chapters
Summary July 7th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Immunohistokemiske metoder er nyttige i honningbiforskning til at detektere og vurdere niveauet af apoptose og nekrose i midgut og hypopharyngeal kirtler hos voksne bier.
Transcript
Denne protokol er nyttig i mange biologiske og toksikologiske undersøgelser af honningbier behandlet med pesticider. Det hjælper med at detektere de cellulære reaktioner af honningbivæv af acaricider, der anvendes i bi-kolonier til behandling mod Varroa-mider. Det er et kraftfuldt værktøj til påvisning af sub-små effekter på væv i kombination med adfærd hos bier eller andre gavnlige insekter.
Til at begynde med skal du forsigtigt tage en arbejderbi med tang og lægge den på is eller fryser ved minus 20 grader Celsius i to minutter for at immobilisere den. Fastgør bien på petriskålen diagonalt gennem den øverste bageste del af brystkassen to gange fra venstre mod højre og fra højre mod venstre. Dårlig insekt saltvand til at dække kroppen.
Placer petriskålen under stereomikroskopet, fokuser og juster. For at dissekere midgut skal du starte med maven ved at indsætte et punkt på saksen under tergite A5 i midten af højre side af bi-kroppen. Klip til tergite A2. Hold saksens indre blad parallelt med siden af kroppen for at undgå at beskadige de indre organer.
Drej saksen til venstre og klip. Åbn forsigtigt den venstre del af maven og fastgør den. Brug tang med den ene hånd til at trække honningbimaven forsigtigt opad og med en saks i den anden hånd skære i slutningen af spiserøret.
Træk maven og midgut væk fra maven og skær ved endetarmen. Brug en pipette med insektsaltopløsning og fjern afføring eller dele af vævet. Til dissektion af hypopharyngeal kirtler, immobilisere en arbejdstagerbi på is som beskrevet før.
Skær hovedet af og læg det på en mindre plade med antennen opad. Fastgør hovedet med to stifter, en gennem det venstre sammensatte øje og den anden gennem det højre sammensatte øje. Lav et snit over det første sammensatte øje på indersiden af stifterne, fortsæt til labrum, og lav derefter endnu et snit på den anden side over det andet sammensatte øje.
Skær antennerne af. Løft masken af og klip, hvor den stadig er fastgjort. Tag tangene og fjern forsigtigt kirtlerne sammen med hjernen og en del af de sammensatte øjne.
Til hæmatoxylin og eosin farvning sættes de afvoksede, rehydrerede sektioner i hæmatoxylin i fem minutter. Placer dem derefter forsigtigt under rindende ledningsvand i to minutter. Sæt dem derefter i destilleret vand i et minut og eosin i fire minutter.
Anbring diasene 96% ethanol i et minut, derefter 2-propanol i to minutter og til sidst i clearingmidlet i to minutter. Tilsæt monteringsmedium og et dækglas og lad dem tørre. Overhold under et lysmikroskop.
Forbered Coplin krukker. Forbered proteinase-K. Efter afvoksning og rehydrering af sektionerne skal du placere diasene i PBS i fem minutter.
Placer diasene fladt i beholderen og tilsæt proteinase-K. Vask diasene i destilleret vand. Sluk i endogen peroxidase ved stuetemperatur.
Skyl rutsjebanerne med PBS eller vand. Placer diasene fladt i beholderen, og påfør ækvilibreringsbuffer i 10 sekunder ved stuetemperatur. Efter aftørring omkring vævet tilsættes det terminale deoxynukleotidyltransferaseenzym til hver sektion og inkuberes i et befugtet kammer i en time ved 37 grader Celsius.
Før inkubation skal du lægge fugtede papirhåndklæder inde i bakken omkring diasene og dække dem med plastfolie. Efter inkubation sættes prøverne på stativet og efterlades i stop-wash buffer. Efter vask af diasene i PBS og aftørring omkring vævene tilsættes to dråber varm anti-digoxigeninperoxidasekonjugat til sektionerne og inkuberes i 30 minutter i en befugtet beholder.
Efter vask i PBS skal du forberede arbejdsstyrkeperoxidasesubstrat, dække sektionerne med peroxidasesubstrat og plette i fem minutter. Placer diaset under mikroskopet og bestem den optimale farvningstid. Efter vask af diasene i et farvningsstativ og destilleret vand, inkuberes diasene i destilleret vand i fem minutter.
Modplet ved hjælp af hæmatoxylin i to minutter. Vask rutsjebanerne ved at placere dem under rindende ledningsvand i tre minutter og derefter i destilleret vand. Monter diasene under glasdæksler og monteringsmedium, og lad det tørre det tørre.
Overhold under et lysmikroskop. Procentdelen af berørte celler blev beregnet ved hjælp af et lysmikroskop. Resultaterne viste, at behandlingen med oxalsyre signifikant påvirkede cellerne i midgut.
Immunostaining viste positive røde eller brune reaktionsprodukter i de apoptotiske kerner af hypopharyngeale kirtler. Positivt reaktionsprodukt efter behandling med imidacloprid eller coumaphos blev bestemt i de fleste kirtelceller. Når du løfter masken på bihovedet, skal du passe på ikke at beskadige eller trække dele af hypopharyngealkirtlerne af.
Denne teknik registrerer subkliniske ændringer i bier og er også velegnet til påvisning af andre miljøpåvirkninger på bier og nogle andre levende organismer.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
