Biology
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Noções Básicas de Histologia e Detecção de Morte Celular em Tecido de Abelhas Melíferas
Chapters
Summary July 7th, 2022
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Métodos imuno-histoquímicos são úteis na pesquisa de abelhas para detectar e avaliar o nível de apoptose e necrose no intestino médio e nas glândulas hipofaríngeas de abelhas adultas.
Transcript
Este protocolo é útil em muitos estudos biológicos e toxicológicos de abelhas tratadas com pesticidas. Ajuda a detectar as respostas celulares do tecido das abelhas melíferas dos acaricidas que são utilizados em colónias de abelhas para o tratamento contra os ácaros Varroa. É uma ferramenta poderosa para a detecção de efeitos sub-pouco sobre o tecido em combinação com o comportamento de abelhas ou outros insetos benéficos.
Para começar, pegue cuidadosamente uma abelha operária com fórceps e coloque-a no gelo ou no congelador a menos 20 graus Celsius por dois minutos para imobilizá-la. Prenda a abelha na placa de Petri diagonalmente através da porção superior traseira do tórax duas vezes da esquerda para a direita e da direita para a esquerda. Pobre soro fisiológico de insetos para cobrir o corpo.
Coloque a placa de Petri sob o estereomicroscópio, foque e ajuste. Para dissecar o intestino médio, comece com o abdômen inserindo um ponto da tesoura sob o tergito A5 no centro do lado direito do corpo da abelha. Corte para o tergito A2. Mantenha a lâmina interna da tesoura paralela com o lado do corpo para evitar danificar os órgãos internos.
Vire a tesoura para a esquerda e corte. Abra suavemente a parte esquerda do abdômen e fixe-a. Usando fórceps com uma mão, puxe suavemente o estômago das abelhas para cima e, com uma tesoura na outra mão, corte no final do esôfago.
Puxe o estômago e o intestino médio para longe do abdômen e corte no reto. Use uma pipeta com solução salina de insetos e remova quaisquer fezes ou partes do tecido. Para dissecção das glândulas hipofaríngeas, imobilize uma abelha operária no gelo, conforme descrito anteriormente.
Corte a cabeça e coloque-a em uma placa menor com a antena voltada para cima. Prenda a cabeça com dois pinos, um através do olho composto esquerdo e o segundo através do olho composto direito. Faça um corte no primeiro olho composto no lado interno dos pinos, continue até o labrum e, em seguida, faça outro corte do outro lado no segundo olho composto.
Corte as antenas. Retire a máscara e corte onde ainda estiver preso. Pegue a pinça e remova cuidadosamente as glândulas junto com o cérebro e parte dos olhos compostos.
Para coloração de hematoxilina e eosina, coloque as seções desparafinadas e reidratadas em hematoxilina por cinco minutos. Em seguida, coloque-os cuidadosamente sob água corrente da torneira por dois minutos. Em seguida, coloque-os em água destilada por um minuto e eosina por quatro minutos.
Coloque as lâminas de etanol a 96% por um minuto, depois 2-propanol por dois minutos e, finalmente, no agente de compensação por dois minutos. Adicione o meio de montagem e um vidro de cobertura e deixe-os secar. Observe sob um microscópio de luz.
Prepare frascos de Coplin. Prepare proteinase-K. Após a desparafinagem e reidratação das seções, coloque as lâminas em PBS por cinco minutos.
Coloque as lâminas planas no recipiente e adicione proteinase-K. Lave as lâminas em água destilada. Têmpera em peroxidase endógena à temperatura ambiente.
Lave as lâminas com PBS ou água. Coloque as lâminas no recipiente e aplique o tampão de equilíbrio por 10 segundos à temperatura ambiente. Depois de limpar o tecido, adicione a enzima desoxinucleotidil transferase terminal a cada seção e incube em uma câmara umidificada por uma hora a 37 graus Celsius.
Antes da incubação, coloque toalhas de papel umedecidas dentro da bandeja ao redor das lâminas e cubra-as com filme plástico. Após a incubação, coloque os espécimes no rack e deixe-os em buffer stop-wash. Depois de lavar as lâminas em PBS e limpar ao redor dos tecidos, adicione duas gotas de conjugado quente anti-digoxigenina peroxidase às seções e incube por 30 minutos em um recipiente umidificado.
Após a lavagem em PBS, prepare o substrato de força de trabalho peroxidase, cubra as seções com substrato de peroxidase e core por cinco minutos. Coloque a lâmina sob o microscópio e determine o tempo de coloração ideal. Depois de lavar as lâminas em um suporte de coloração e água destilada, incubar as lâminas em água destilada por cinco minutos.
Contra-coloração usando hematoxilina por dois minutos. Lave as lâminas colocando-as sob água corrente da torneira por três minutos e, em seguida, em água destilada. Monte as lâminas sob as lâminas de cobertura de vidro e o meio de montagem e deixe plana para secar.
Observe sob um microscópio de luz. A porcentagem de células afetadas foi calculada usando um microscópio de luz. Os resultados indicaram que o tratamento com ácido oxálico afetou significativamente as células do intestino médio.
A imunocoloração mostrou produtos de reação vermelhos ou marrons positivos nos núcleos apoptóticos das glândulas hipofaríngeas. O produto de reação positiva após o tratamento com imidaclopride ou coumaphos foi determinado na maioria das células glandulares. Ao levantar a máscara da cabeça de abelha, tome cuidado para não danificar ou retirar as partes das glândulas hipofaríngeas.
Esta técnica detecta alterações subclínicas nas abelhas e também é adequada para a detecção de outros efeitos ambientais nas abelhas e em alguns outros organismos vivos.
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