Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Histologi grunder och celldödsdetektering i honungsbivävnad
Chapters
Summary July 7th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Immunohistokemiska metoder är användbara i honungsbiforskning för att upptäcka och bedöma nivån av apoptos och nekros i midgut- och hypofaryngeala körtlar hos vuxna bin.
Transcript
Detta protokoll är användbart i många biologiska och toxikologiska studier av honungsbin behandlade med bekämpningsmedel. Det hjälper till att upptäcka cellulära svar från honungsbivävnad av akaricider som används i bikolonier för behandling mot Varroa-kvalster. Det är ett kraftfullt verktyg för detektering av sub-little effekter på vävnad i kombination med beteende hos bin eller andra fördelaktiga insekter.
För att börja, ta försiktigt en arbetarbi med pincett och lägg den på is eller frys vid minus 20 grader Celsius i två minuter för att immobilisera den. Fäst biet på petriskålen diagonalt genom den översta bakre delen av bröstkorgen två gånger från vänster till höger och från höger till vänster. Dålig insektssaltlösning för att täcka kroppen.
Placera petriskålen under stereomikroskopet, fokusera och justera. För att dissekera midguten, börja med buken genom att sätta in en punkt på saxen under tergite A5 i mitten av bikroppens högra sida. Skär till tergite A2. Håll saxens inre blad parallellt med kroppens sida för att undvika att skada de inre organen.
Vrid saxen åt vänster och klipp. Öppna försiktigt den vänstra delen av buken och stift den. Använd pincett med ena handen, dra försiktigt honungsbimagen uppåt och med sax i den andra handen, skär i slutet av matstrupen.
Dra magen och midguten bort från buken och skär i ändtarmen. Använd en pipett med insektssaltlösning och ta bort avföring eller delar av vävnaden. För dissektion av hypofaryngeala körtlar, immobilisera en arbetarbi på is som beskrivits tidigare.
Klipp av huvudet och lägg det på en mindre platta med antennen uppåt. Säkra huvudet med två stift, en genom det vänstra sammansatta ögat och den andra genom det högra sammansatta ögat. Gör ett snitt över det första sammansatta ögat på insidan av stiften, fortsätt till labrum och gör sedan ett nytt snitt på andra sidan över det andra sammansatta ögat.
Klipp av antennerna. Lyft av masken och skär där den fortfarande är fäst. Ta pincetten och ta försiktigt bort körtlarna tillsammans med hjärnan och en del av de sammansatta ögonen.
För hematoxylin och eosinfärgning, lägg de avvaxade, rehydrerade sektionerna i hematoxylin i fem minuter. Placera dem sedan försiktigt under rinnande kranvatten i två minuter. Lägg dem sedan i destillerat vatten i en minut och eosin i fyra minuter.
Placera bilderna 96% etanol i en minut sedan 2-propanol i två minuter och slutligen i clearingmedlet i två minuter. Tillsätt monteringsmedium och ett täckglas och låt dem torka. Observera under ett ljusmikroskop.
Förbered Coplin-burkar. Förbered proteinas-K. Efter avvaxning och rehydrering av sektionerna, placera bilderna i PBS i fem minuter.
Placera glasrutschbanorna platt i behållaren och tillsätt proteinas-K. Tvätta bilderna i destillerat vatten. Släck i endogent peroxidas vid rumstemperatur.
Skölj bilderna med PBS eller vatten. Placera bilderna plant i behållaren och applicera jämviktsbuffert i 10 sekunder vid rumstemperatur. Efter att ha torkat runt vävnaden, tillsätt det terminala deoxinukleotidyltransferasenzymet till varje sektion och inkubera i en fuktad kammare i en timme vid 37 grader Celsius.
Före inkubation, lägg fuktade pappershanddukar inuti brickan runt bilderna och täck dem med plastfolie. Efter inkubation, lägg proverna på stället och lämna dem i stop-wash buffert. Efter att ha tvättat bilderna i PBS och torkat runt vävnaderna, tillsätt två droppar varmt anti-digoxigeninperoxidaskonjugat till sektionerna och inkubera i 30 minuter i en fuktad behållare.
Efter tvättning i PBS, förbered arbetsstyrka-peroxidassubstrat, täck sektionerna med peroxidassubstrat och fläcka i fem minuter. Placera bilden under mikroskopet och bestäm den optimala färgningstiden. Efter tvättning av bilderna i ett färgningsställ och destillerat vatten, inkubera bilderna i destillerat vatten i fem minuter.
Motfläck med hematoxylin i två minuter. Tvätta bilderna genom att placera dem under rinnande kranvatten i tre minuter och sedan i destillerat vatten. Montera bilderna under glaslock och monteringsmedium och låt stå platt för att torka.
Observera under ett ljusmikroskop. Procentandelen drabbade celler beräknades med hjälp av ett ljusmikroskop. Resultaten indikerade att behandlingen med oxalsyra signifikant påverkade cellerna i midguten.
Immunostaining visade positiva röda eller bruna reaktionsprodukter i de apoptotiska kärnorna i hypofaryngeala körtlar. Positiv reaktionsprodukt efter behandling med imidakloprid eller kumaros bestämdes i majoriteten av körtelcellerna. När du lyfter masken på bihuvudet, var försiktig så att du inte skadar eller drar av delarna av hypofaryngealkörtlarna.
Denna teknik upptäcker subkliniska förändringar hos bin och är också lämplig för detektering av andra miljöeffekter på bin och vissa andra levande organismer.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
