Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Automatische scheiding en verzameling van kankergerelateerde stoffen uit klinische monsters
Chapters
Summary January 13th, 2023
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Dit artikel beschrijft de toepassing van geautomatiseerde apparatuur om stoffen, zoals celvrij DNA en circulerende tumorcellen, eenvoudig en efficiënt te scheiden en te verzamelen uit volbloed.
Transcript
Ons protocol is gebruiksvriendelijk. Met behulp van deze techniek kan iedereen gemakkelijk componenten uit het bloed isoleren. Vervuiling kan worden geminimaliseerd en materialen kunnen nauwkeurig worden gescheiden.
Met automatisering en de vaststelling van dit protocol kunnen onderzoekers gemakkelijk kankergerelateerde stoffen met een hoge zuiverheid verkrijgen, wat nuttig is voor verschillende downstream-studies. In het bijzonder wordt verwacht dat het belangrijke voordelen zal bieden voor eindgebruikersonderzoek. Jay Jeong, een senior onderzoeker en assistent-manager bij het Cancer Genomics Research Institute, demonstreert hun procedure.
Om te beginnen laadt u de LBx 1-cartridge door het cartridgetype te selecteren op het touchscreenpaneel van het instrument. Druk op de pijlknop om het aantal monsters te wijzigen. Open vervolgens de instrumentdeur en plaats alle te gebruiken cartridges in volgorde van het nummer op de cartridgehouder.
Voor in totaal vier cartridges plaatst u de dummycartridge in de lege ruimte van de cartridgehouder. Gebruik het steunwiel om de cartridge te monteren en draai de borgmoer vast om deze vast te zetten. Sluit de deur en druk op de run-knop op het touchpad-scherm.
Het instrument sluit de kleppen op de patronen, wat ongeveer 30 seconden duurt. Volg het bericht om de deur te openen. Verwijder het steunwiel en verwijder de met de klep gesloten cartridge uit de cartridgehouder.
Pipetteer maximaal 10 milliliter van een volbloedmonster met behulp van een serologische pipet. Steek de pipetpunt diep in de monsterinlaat van de patroon en injecteer langzaam het volbloedmonster. Nadat u de patronen in het instrument hebt geplaatst, sluit u de deur van het instrument en drukt u op de knop OK.
Plasma en buffy jassen worden automatisch gescheiden van volbloed, wat ongeveer 30 minuten duurt. Zodra het plasma en de buffy coat zijn gescheiden, verschijnt er een bericht op het scherm vergezeld van een alarmgeluid. Stop het alarm door de deur te openen of op de stopknop te drukken.
Open de deur. Verwijder de cartridge en plaats deze op tafel. Herstel drie milliliter plasma uit de plasma-uitlaat met behulp van een pipetpunt van één milliliter.
Herstel vervolgens drie milliliter van de buffy-vacht uit de buffy coat-uitlaat met behulp van een pipetpunt van één milliliter. Laad vervolgens de LBx 2-cartridge door de cartridgenaam op het touchscreenpaneel van het instrument te selecteren. Druk op de pijlknop om het aantal monsters te wijzigen en volg dezelfde procedure als voor de LBx 1-cartridge om de cartridge in de cartridgehouder te plaatsen.
Nadat u de cartridge hebt geplaatst en de deur hebt gesloten, drukt u op de run-knop op het touchpad-scherm. Volg de eerder beschreven procedure om de met de klep gesloten cartridge uit de cartridgehouder te verwijderen en op tafel te plaatsen. Pipetteer de dichtheidsgradiëntoplossing met behulp van een serologische pipet.
Steek de pipetpunt diep in de inlaat van de patroon en injecteer de oplossing langzaam. Pipetteer vervolgens het volbloedmonster en injecteer het langzaam in de monsterinlaat. Nadat u de cartridge hebt geplaatst en vastgezet, sluit u de deur en drukt u op de knop OK.
Zodra het plasma en de PBMC automatisch van volbloed worden gescheiden, verschijnt er een bericht vergezeld van een alarmgeluid. Open de deur en verwijder de patroon. Herstel drie milliliter plasma uit de plasma-uitgang met behulp van een pipetpunt van één milliliter en herstel vervolgens drie milliliter van de PBMC-uitgang.
Evenzo, voor de FAST-auto cartridge, na het verwijderen van de klep-gesloten cartridge uit de cartridgehouder, injecteert u zes milliliter van de PBS-oplossing in de PBS-inlaat van de cartridge. Pipetteer vervolgens drie milliliter volbloed of buffy coat verkregen uit LBx 1, of PBMC-monster verkregen uit LBx 2, en injecteer het monster langzaam in de monsterinlaat van de patroon. Nadat u de cartridge hebt geplaatst en vastgezet, sluit u de deur en drukt u op de knop OK.
Zodra de automatische verrijking van CTC's is voltooid, stopt u het alarm. Verwijder de cartridge en plaats de achterplaatverwijderaar, of BPR, in de vier gaten aan de voorkant van de cartridge. Druk op de donkerblauwe vleugel met de duimen van beide handen en druk vervolgens op het lichtblauwe lichaam totdat het klikt.
Verwijder de cartridgebehuizing voorzichtig door deze op te tillen. Pak het filtermembraan heel voorzichtig bij de rand met een pincet en plaats het membraan in een buis van 1,5 milliliter voor nucleïnezuurbereiding of op een schuifglas voor de kleuring. Herstel indien nodig het gefilterde bloed naar de bloeduitlaat met behulp van een pipetpunt van één milliliter.
De geëxtraheerde cfDA's werden geëvalueerd met behulp van Bioanalyzer en cfDNA-schermtapes werden gebruikt in combinatie met een elektronische ladder. De groene lijn werd gebruikt om de ladder en het monster uit te lijnen. De driehoekmarkeringen geven de DNA-band aan.
De meeste cfDNA's hebben een lengte van 166 basenparen en sommige bestaan in gehele veelvouden van lengte. Meestal meet de concentratie van cfDNA tot de grootte van 50 tot 700 basenparen. Hoewel er een verschil is in de hoeveelheid verkregen uit elk individueel monster, zoals 8,47 nanogram per milliliter en 5,2 nanogram per milliliter, waren de resultaten van cfDNA-extractie in alle gevallen goed voor zowel de concentratie als de grootteverdeling.
Deze resultaten geven aan dat de LBx 1-methode plasma dat cfDNA bevat nauwkeurig scheidt. In FAST-auto werd het membraan verwijderd en gekleurd met fluorescerende antilichamen om CTC's en witte bloedcellen te detecteren. Het gebrandschilderde membraan, geplaatst op glazen dia's, werd waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop.
Na membraankleuring vertonen cellen DAPI- of nucleair-positieve signalen in blauw, terwijl EpCAM en CK of CTC's positief in het groen worden gemarkeerd en CD45- of WBC-positieve in rood worden gemarkeerd. Het is niet moeilijk om het membraan te verwijderen. Het is echter noodzakelijk om voorzichtig te zijn met het verlies en de besmetting van CTC's.
Volbloed, PBMC en buffy coat zijn allemaal beschikbaar. In plaats daarvan hoeft u alleen maar het hele volume in te stellen. Andere vloeistoffen kunnen ook worden gebruikt, hoewel testen vereist is.
Deze techniek kan direct in ziekenhuizen worden gebruikt en de stof kan snel worden verkregen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
